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Construction manuelle d’un microréseau tissulaire à l’aide de la méthode du ruban adhésif et d’un microréseau portatif
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Summary June 10th, 2022
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Ce protocole décrit la méthode du ruban adhésif sur la façon de construire manuellement un microréseau tissulaire à l’aide de blocs de donneurs FFPE de différentes profondeurs.
Transcript
Le microréseau tissulaire, ou TMA, est un outil de recherche important qui assemble de petits morceaux exemplaires de tissus connus sous le nom de noyaux tissulaires à partir de blocs de tissus incorporés à la paraffine fixés au formol, appelés blocs de donneur, en un seul bloc de paraffine. La méthode du ruban adhésif est une méthode de construction entièrement manuelle qui inverse le processus de construction en coulant le bloc autour de noyaux verticaux et est donc compatible avec les blocs donneurs non idéaux et utilise des microréseaux de tissu portables jetables peu coûteux et largement disponibles. Le flux de travail en plusieurs étapes de ce processus sera démontré par M. Lee Wisner et le Dr Brandon Larsen.
L’un des concepts les plus importants à retenir lors de la construction de blocs TMA est le fait que les tissus dans les blocs de tissus incorporés à la paraffine fixée au formol sont en fait des structures tridimensionnelles. Nous avons développé une animation ici pour aider à expliquer ce concept. Ce que vous voyez ici est une animation représentant un bloc de tissu incorporé à la paraffine fixé au formol montrant la nature tridimensionnelle de ce tissu dans le bloc.
Vous pouvez voir que le tissu est visible en haut du bloc et que cette zone est assez grande. Si nous pouvions avoir une vision aux rayons X, pour ainsi dire, et voir à travers le bloc, nous pourrions voir que le tissu n’est pas uniformément formé plus profondément dans ce bloc, presque comme un iceberg dans l’océan, où ce que vous voyez à la surface peut ne pas représenter ce qui est en dessous. À l’intérieur de ce bloc de tissu, il peut y avoir des morceaux de tissu supplémentaires qui ne sont pas visibles à la surface.
Il peut y avoir des zones de nécrose ou de mort tissulaire au centre de ce tissu plus profondément. Un pathologiste devrait en fait examiner cette section bidimensionnelle du haut de ce bloc de tissu, puis annoter cette diapositive pour montrer les zones qui contiennent le tissu d’intérêt et exclure la nécrose ou d’autres types de tissus qui ne sont pas réellement d’intérêt. Pour faciliter l’échantillonnage approprié du tissu, le pathologiste doit faire trois choses.
Tout d’abord, à l’aide d’un stylo de marquage de diapositive, le pathologiste marquera le tissu d’intérêt sur la diapositive afin que d’autres tissus puissent être évités. Deuxièmement, s’il y a des zones dans cette zone d’intérêt qui devraient être évitées, le pathologiste peut utiliser le même stylo de marquage pour effacer les zones qui ne devraient pas être échantillonnées. Et enfin, de préférence en utilisant une couleur de stylo différente, le pathologiste doit marquer les zones idéales dans la zone d’intérêt pour l’échantillonnage du noyau et la construction de TMA.
Il est important de garder à l’esprit que lorsque ce processus est terminé, la composition tissulaire peut changer plus profondément à partir de l’endroit où un échantillon de noyau est obtenu et nous le montrerons ici dans l’animation, que l’emplacement du noyau déterminera la composition de ce noyau, qui variera en fonction de la profondeur du tissu et de ce qui est présent dans ce bloc. Par exemple, ici, le premier noyau que nous illustrons capture une partie du tissu dans sa moitié supérieure, mais plus profondément dans le bloc, il n’y a plus de tissu présent d’où ce noyau est obtenu, de sorte que seule la cire de paraffine a été échantillonnée. Le deuxième noyau que nous avons illustré ici a capturé du tissu sur toute sa longueur parce que le tissu est présent sur toute la profondeur de ce bloc à cet endroit.
Le troisième noyau a capturé une partie de tissu, puis a capturé une partie de cire de paraffine au centre où il n’y avait pas de tissu présent, puis a capturé un peu plus de tissu à son extrémité inférieure où il y avait du tissu dans la partie inférieure de ce bloc. Une fois l’examen de la pathologie terminé, compilez la liste finale des blocs donneurs à utiliser dans la construction de l’AMT, puis créez une carte de l’AMT. La carte de l’AMT est un schéma décrivant où les carottes seront situées dans l’AMT terminée et les sections de tissus montées sur glissière coupées à partir de l’AMT résultante.
À des fins d’orientation, assurez-vous que la carte TMA évite de placer des noyaux dans une matrice paire telle qu’une matrice trois par trois ou quatre par quatre et comprend au moins un marqueur d’orientation. Étant donné que la méthode du ruban inverse le processus de construction en versant de la cire fondue autour des noyaux inversés, cela nécessite la création d’une deuxième carte connue sous le nom de carte de construction qui est une image miroir de la carte TMA. La carte de construction indique où chaque carotte doit être placée pendant la construction afin d’apparaître au bon endroit dans la TMA terminée.
Une fois les cartes créées, préparez le moule de base TMA en métal. Pour guider le placement du noyau, utilisez une grille à carreaux de papier jetable. Coupez la grille à carreaux de papier à la taille et fixez un morceau de ruban adhésif double adhésif à l’arrière de la grille.
Placez la grille et le ruban adhésif dans le plateau métallique et ajoutez un deuxième morceau de ruban adhésif double sur le dessus de la grille. Superposez la lame H&E examinée par la pathologie sur le bloc de tissu FFPE à poinçonner et utilisez les marques du pathologiste pour identifier où le bloc tissulaire doit être poinçonné. À l’aide d’un poinçon manuel portatif, jetable ou réutilisable, poinçonnez le bloc donneur FFPE dans la région appropriée.
Si vous utilisez un poinçon réutilisable, assurez-vous qu’il est nettoyé avant et après chaque poinçon de tissu. Éjectez le noyau du poinçon de noyau. Utilisez un pic à aiguille pour placer le noyau éjecté sur le réticule de la grille recouverte de ruban adhésif à double bâton.
Assurez-vous que le noyau est placé de manière inversée et verticale de manière à ce que l’extrémité tissulaire du noyau entre en contact avec le ruban adhésif et se trouve au bon endroit, comme indiqué sur la carte de construction. Répétez l’opération jusqu’à ce que tous les blocs donneurs soient carottés et que les noyaux soient placés à leur position appropriée. Une fois que tous les noyaux sont en place, étiquetez une cassette en plastique et placez-la sur la base métallique contenant les noyaux.
La hauteur des noyaux ne doit pas dépasser la profondeur du plateau métallique car les noyaux hauts seront inclinés ou renversés lorsque la cassette sera mise en place. Versez doucement la paraffine fondue à travers la cassette dans le plateau de noyaux. Laissez la paraffine fondue déborder pour vous assurer qu’il n’y a pas de bulles d’air dans le corps de la TMA.
Assurez-vous que la paraffine se remplit jusqu’au sommet de la cassette de manière à ce que la cassette soit intégrée et fermement liée au bloc de paraffine une fois qu’elle est solidifiée. Laissez le bloc refroidir à température ambiante pendant 30 minutes et ne déplacez pas le bloc pendant ce temps. Réfrigérer le bloc à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes supplémentaires pour le solidifier complètement.
Une fois complètement réglé, séparez délicatement le moule de base en métal et retirez le ruban adhésif double du bloc de paraffine. Une fois le TMA construit, utilisez un microtome pour sectionner le nouveau TMA. Une fois que le bloc a été correctement face, prélever des sections de tissus complets du visage.
Transférez les sections dans un bain-marie préchauffé et montez les sections de tissus sur glissière. Une fois sec, soumettez des sections représentatives pour la coloration H & E et toute coloration immunohistochimique supplémentaire qui pourrait être nécessaire. Soumettre les sections TMA colorées pour examen pathologique.
Pour la validation de l’AMT, le pathologiste doit examiner la lame H&E du bloc TMA et examiner chaque point circulaire sous le microscope pour voir si le tissu d’intérêt est présent. Un élément essentiel du processus de construction est l’identification des tissus d’intérêt dans un bloc de donneur donné à partir duquel le noyau de TMA doit être obtenu. La première colonne de cette figure montre des H&E de donneurs exemplaires avec les marques du pathologiste.
La deuxième colonne montre la zone poinçonnée des tissus colorés H & E. La troisième colonne montre le tissu coloré H & E des noyaux TMA qui ont été récoltés dans les blocs donneurs dans les zones indiquées dans les colonnes un et deux. Le pathologiste peut examiner ensemble le bloc de donneurs appariés et les H&E de base de TMA pour valider que la zone d’intérêt a été collectée et que la composition tissulaire est la même.
Il existe deux mesures principales pour la réussite d’un TMA par la méthode de la bande. Le premier est la présence de points de noyau tissulaire aux positions et à la distance attendues les uns des autres, qui est évaluée par inspection visuelle. Les images présentées en A et B représentent deux TMA de méthode de bande réussis et les diapositives H&E correspondantes.
Les inspections visuelles de ces blocs TMA montrent que les noyaux sont présents et régulièrement espacés dans chaque TMA et leurs sections correspondantes. Certains des principaux problèmes de construction qui peuvent survenir au cours du processus de construction de la méthode de bande comprennent la séparation du bloc et de la cassette en raison du retrait prématuré de la base métallique avant la solidification, comme le montre l’image C.Le renversement du noyau et / ou la dérive de placement des noyaux intégrés, comme le montre l’image D, peut se produire lors d’un versement excessivement turbulent de la paraffine fondue, qui peut être aggravé par du ruban adhésif double face mal adhésif. Cette figure montre que la coloration H&E pour chacun des noyaux est un TMA exemplaire.
Tous les points centraux sauf un sont présents dans le H & E. La figure montre également que certains des noyaux sont présents sous forme de points de tissu circulaires complets, tandis que d’autres ne sont pas complètement présents. Une telle perte de tissu n’est pas rare et peut être due à un bloc insuffisant pour révéler tous les noyaux dans leur intégralité.
Alternativement, la présence de tissu incomplet ou total peut provenir d’une mauvaise qualité tissulaire de ce noyau, ce qui peut entraîner une perte de tissu pendant le processus de coloration. Dans cette figure suivante, l’immunohistochimie et la coloration de l’ARN ISH ont été effectuées sur les sections de TMA pour valider davantage la TMA. Comme indiqué ici, une variété de taches peuvent être utilisées en fonction du tissu utilisé pour construire la TMA.
Vimentin est utilisé comme contrôle de qualité. U6 est un indicateur de la qualité de l’ARN. EBER est utilisé pour déterminer l’état EBV.
Et CD20 est un marqueur de cellules B pour indiquer la présence de cellules B. Ce sont quelques taches qui peuvent être utilisées pour aider à valider votre TMA. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez comprendre comment fabriquer un microréseau tissulaire à l’aide de la méthode de la bande et pourquoi les ATM sont des outils de recherche importants pour économiser du temps et des ressources.
Vous devez également comprendre que la construction de TMA n’est pas un processus idéal et que le guidage et l’examen pathologiques continus sont des composants essentiels non seulement pendant le processus de construction, mais également pour les études immunohistochimiques effectuées sur des sections de TMA afin de s’assurer que le tissu d’intérêt est effectivement présent dans la section TMA.
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