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टेप विधि और एक Handheld माइक्रोएरेयर का उपयोग कर एक ऊतक माइक्रोएरे का मैनुअल निर्माण
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Summary June 10th, 2022
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यह प्रोटोकॉल टेप विधि को रेखांकित करता है कि अलग-अलग गहराई के एफएफपीई दाता ब्लॉकों का उपयोग करके मैन्युअल रूप से एक ऊतक माइक्रोएरे का निर्माण कैसे किया जाए।
Transcript
ऊतक माइक्रोएरे, या टीएमए, एक महत्वपूर्ण शोध उपकरण है जो ऊतक के छोटे अनुकरणीय टुकड़ों को इकट्ठा करता है जिसे फॉर्मेलिन-फिक्स्ड पैराफिन एम्बेडेड ऊतक ब्लॉकों से ऊतक कोर के रूप में जाना जाता है, जिसे दाता ब्लॉक के रूप में जाना जाता है, एक एकल पैराफिन ब्लॉक में। टेप विधि एक पूरी तरह से मैनुअल निर्माण विधि है जो सीधे कोर के चारों ओर ब्लॉक कास्टिंग द्वारा निर्माण प्रक्रिया को उलट देती है और इस प्रकार गैर-आदर्श दाता ब्लॉकों के साथ संगत है और सस्ती, व्यापक रूप से उपलब्ध डिस्पोजेबल हैंडहेल्ड ऊतक माइक्रोएरेयर का उपयोग करती है। इस प्रक्रिया के बहु-चरणीय वर्कफ़्लो को Mr.Lee Wisner और Dr.Brandon Larsen द्वारा प्रदर्शित किया जाएगा।
टीएमए ब्लॉकों का निर्माण करते समय याद रखने के लिए सबसे महत्वपूर्ण अवधारणाओं में से एक यह तथ्य है कि फॉर्मेलिन-फिक्स्ड पैराफिन एम्बेडेड ऊतक ब्लॉकों में ऊतक वास्तव में तीन = आयामी संरचनाएं हैं। हमने इस अवधारणा को समझाने में मदद करने के लिए यहां एक एनीमेशन विकसित किया है। आप यहां जो देख रहे हैं वह एक एनीमेशन है जो एक फॉर्मेलिन-फिक्स्ड पैराफिन एम्बेडेड ऊतक ब्लॉक को दर्शाता है जो ब्लॉक के भीतर उस ऊतक की तीन आयामी प्रकृति दिखाता है।
आप देख सकते हैं कि ऊतक ब्लॉक के शीर्ष पर दिखाई दे रहा है और वह क्षेत्र काफी बड़ा है। यदि हम एक्स-रे दृष्टि रखने में सक्षम थे, जैसा कि यह था, और ब्लॉक के माध्यम से देखते हैं, तो हम देख सकते हैं कि ऊतक वास्तव में उस ब्लॉक के भीतर समान रूप से गहरे आकार का नहीं है, लगभग समुद्र में एक हिमशैल की तरह, जहां आप सतह पर जो देखते हैं वह वास्तव में नीचे क्या है इसका प्रतिनिधित्व नहीं कर सकता है। उस ऊतक ब्लॉक के भीतर अतिरिक्त ऊतक टुकड़े हो सकते हैं जो सतह पर दिखाई नहीं देते हैं।
उस ऊतक के केंद्र के भीतर परिगलन या ऊतक मृत्यु के क्षेत्र गहरे नीचे हो सकते हैं। एक रोगविज्ञानी को वास्तव में उस ऊतक ब्लॉक के शीर्ष से उस दो-आयामी अनुभाग की समीक्षा करनी चाहिए और फिर उस स्लाइड को उन क्षेत्रों को दिखाने के लिए एनोटेट करना चाहिए जिनमें ब्याज के ऊतक होते हैं और नेक्रोसिस या अन्य प्रकार के ऊतकों को छोड़कर जो वास्तव में रुचि के नहीं हैं। ऊतक के उचित कोर नमूने की सुविधा के लिए, रोगविज्ञानी को तीन चीजें करनी चाहिए।
सबसे पहले, स्लाइड मार्किंग पेन का उपयोग करके, रोगविज्ञानी स्लाइड पर ब्याज के ऊतक को चिह्नित करेगा ताकि अन्य ऊतकों से बचा जा सके। दूसरा, यदि ब्याज के उस क्षेत्र के भीतर ऐसे क्षेत्र हैं जिनसे बचा जाना चाहिए, तो रोगविज्ञानी उन क्षेत्रों को धब्बा देने के लिए एक ही अंकन पेन का उपयोग कर सकता है जिन्हें नमूना नहीं दिया जाना चाहिए। और अंत में, अधिमानतः कलम के एक अलग रंग का उपयोग करके, रोगविज्ञानी को उन क्षेत्रों को चिह्नित करना चाहिए जो कोर सैंपलिंग और टीएमए निर्माण के लिए ब्याज के क्षेत्र के भीतर आदर्श हैं।
यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि जब यह प्रक्रिया पूरी हो जाती है कि ऊतक संरचना गहराई से बदल सकती है जहां से एक कोर नमूना प्राप्त किया जाता है और हम इसे एनीमेशन में यहां दिखाएंगे, कि कोर का स्थान उस कोर की संरचना को निर्धारित करेगा, जो ऊतक की गहराई से भिन्न होगा और उस ब्लॉक के भीतर क्या मौजूद है। उदाहरण के लिए, यहां पहला कोर जिसे हम चित्रित कर रहे हैं, वह अपने ऊपरी आधे हिस्से में ऊतक के एक हिस्से पर कब्जा कर रहा है, लेकिन ब्लॉक के भीतर गहरा अब कोई ऊतक मौजूद नहीं है जहां उस कोर से प्राप्त किया जाता है, इसलिए केवल पैराफिन मोम का नमूना लिया गया है। हमने यहां सचित्र दूसरे कोर ने अपनी पूरी लंबाई के साथ ऊतक पर कब्जा कर लिया है क्योंकि ऊतक उस स्थान पर उस ब्लॉक की पूरी गहराई में मौजूद है।
तीसरे कोर ने ऊतक के एक हिस्से पर कब्जा कर लिया है और फिर केंद्र में पैराफिन मोम के एक हिस्से पर कब्जा कर लिया है जहां कोई ऊतक मौजूद नहीं था और फिर इसके निचले छोर पर थोड़ा और ऊतक पर कब्जा कर लिया गया था जहां उस ब्लॉक के निचले हिस्से में ऊतक था। एक बार पैथोलॉजी समीक्षा पूरी हो जाने के बाद, टीएमए निर्माण में उपयोग किए जाने वाले दाता ब्लॉकों की अंतिम सूची संकलित करें, फिर एक टीएमए मानचित्र बनाएं। टीएमए मानचित्र एक योजनाबद्ध रूपरेखा है जहां कोर पूर्ण टीएमए में स्थित होंगे और परिणामी टीएमए से कटौती की गई स्लाइड-माउंटेड ऊतक वर्गों में स्थित होंगे।
अभिविन्यास उद्देश्यों के लिए, सुनिश्चित करें कि टीएमए मानचित्र एक सम मैट्रिक्स में कोर रखने से बचता है जैसे कि तीन से तीन या चार से चार मैट्रिक्स और इसमें कम से कम एक अभिविन्यास मार्कर शामिल है। क्योंकि टेप विधि उल्टे कोर के चारों ओर पिघले हुए मोम डालकर निर्माण प्रक्रिया को उलट देती है, इसलिए इसके लिए एक दूसरे मानचित्र के निर्माण की आवश्यकता होती है जिसे निर्माण मानचित्र के रूप में जाना जाता है जो टीएमए मानचित्र की एक दर्पण छवि है। निर्माण मानचित्र से पता चलता है कि पूर्ण टीएमए में सही स्थान पर दिखाई देने के लिए निर्माण के दौरान प्रत्येक कोर को कहां रखा जाना चाहिए।
एक बार मानचित्र बनाए जाने के बाद, धातु टीएमए बेस मोल्ड तैयार करें। कोर प्लेसमेंट का मार्गदर्शन करने के लिए एक डिस्पोजेबल पेपर चेकर ग्रिड का उपयोग करें। कागज चेकर ग्रिड को आकार में काटें और ग्रिड के पीछे डबल-स्टिक टेप का एक टुकड़ा चिपकाएं।
ग्रिड और टेप को धातु ट्रे में रखें और ग्रिड के शीर्ष पर डबल-स्टिक टेप का दूसरा टुकड़ा जोड़ें। एफएफपीई ऊतक ब्लॉक पर पैथोलॉजी-समीक्षा की गई एच एंड ई स्लाइड को छिद्रित करने के लिए ओवरले करें और रोगविज्ञानी के निशान का उपयोग यह पहचानने के लिए करें कि ऊतक ब्लॉक को कहां छिद्रित किया जाना है। एक हैंडहेल्ड मैनुअल कोर पंच, डिस्पोजेबल या पुन: प्रयोज्य का उपयोग करके, उचित क्षेत्र में एफएफपीई दाता ब्लॉक को पंच करें।
यदि पुन: प्रयोज्य कोर पंच का उपयोग कर रहे हैं, तो सुनिश्चित करें कि इसे प्रत्येक ऊतक पंच से पहले और बाद में साफ किया जाता है। कोर पंच से कोर को बाहर निकालें। डबल-स्टिक टेप-कवर ग्रिड के क्रॉसहेयर पर निकाले गए कोर को रखने के लिए एक सुई पिक का उपयोग करें।
सुनिश्चित करें कि कोर को एक उल्टे, सीधे तरीके से रखा गया है जैसे कि कोर का ऊतक अंत टेप से संपर्क करता है और निर्माण मानचित्र द्वारा दर्शाए गए सही स्थान पर है। तब तक दोहराएं जब तक कि सभी दाता ब्लॉकों को कोर नहीं किया जाता है और कोर को उनके उपयुक्त पदों पर रखा जाता है। एक बार जब सभी कोर जगह में होते हैं, तो एक प्लास्टिक कैसेट को लेबल करें और इसे कोर वाले धातु आधार के शीर्ष पर रखें।
कोर की ऊंचाई धातु ट्रे की गहराई से अधिक नहीं होनी चाहिए क्योंकि कैसेट को जगह में रखे जाने पर लंबे कोर को झुकाया या गिरा दिया जाएगा। धीरे से कोर की ट्रे में कैसेट के माध्यम से पिघले हुए पैराफिन डालें। पिघले हुए पैराफिन को यह सुनिश्चित करने के लिए ओवरफ्लो करने की अनुमति दें कि टीएमए के शरीर में कोई हवा के बुलबुले नहीं हैं।
सुनिश्चित करें कि पैराफिन कैसेट के शीर्ष पर भरता है जैसे कि कैसेट एम्बेडेड है और एक बार ठोस होने के बाद पैराफिन ब्लॉक से दृढ़ता से बंधा हुआ है। ब्लॉक को 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ठंडा होने दें और इस समय के दौरान ब्लॉक को स्थानांतरित न करें। पूरी तरह से ठोस करने के लिए अतिरिक्त 30 मिनट के लिए ब्लॉक को चार डिग्री सेल्सियस पर ठंडा करें।
एक बार पूरी तरह से सेट होने के बाद, धीरे से धातु बेस मोल्ड को अलग करें और पैराफिन ब्लॉक से डबल-स्टिक टेप को हटा दें। एक बार टीएमए का निर्माण हो जाने के बाद, नए टीएमए को अनुभाग करने के लिए एक माइक्रोटोम का उपयोग करें। एक बार ब्लॉक का उचित रूप से सामना करने के बाद, पूर्ण-चेहरे के ऊतक वर्गों को इकट्ठा करें।
अनुभागों को एक पूर्व-गर्म पानी के स्नान में स्थानांतरित करें और ऊतक वर्गों को स्लाइड-माउंट करें। एक बार सूखने के बाद, एच एंड ई धुंधला और किसी भी अतिरिक्त इम्यूनोहिस्टोकेमिकल दाग के लिए प्रतिनिधि वर्गों को प्रस्तुत करें जो आवश्यक हो सकते हैं। पैथोलॉजिकल समीक्षा के लिए दाग टीएमए वर्गों को सबमिट करें।
टीएमए सत्यापन के लिए, रोगविज्ञानी को टीएमए ब्लॉक से एच एंड ई स्लाइड की समीक्षा करनी चाहिए और माइक्रोस्कोप के नीचे प्रत्येक परिपत्र स्थान की समीक्षा करनी चाहिए ताकि यह देखा जा सके कि ब्याज का ऊतक मौजूद है या नहीं। निर्माण प्रक्रिया का एक महत्वपूर्ण घटक किसी दिए गए दाता ब्लॉक में रुचि के ऊतकों की पहचान है जहां से टीएमए कोर प्राप्त किया जाना चाहिए। इस आकृति का पहला स्तंभ रोगविज्ञानी के निशान के साथ अनुकरणीय दाता एच एंड ई दिखाता है।
दूसरा कॉलम एच एंड ई दाग ऊतकों के छिद्रित क्षेत्र को दर्शाता है। तीसरा कॉलम टीएमए कोर के एच एंड ई दाग ऊतक को दिखाता है जो कॉलम एक और दो में दिखाए गए क्षेत्रों में दाता ब्लॉकों से काटा गया था। रोगविज्ञानी मिलान किए गए दाता ब्लॉक और टीएमए कोर एच एंड ई को एक साथ देख सकते हैं ताकि यह सत्यापित किया जा सके कि ब्याज का क्षेत्र एकत्र किया गया था और ऊतक संरचना समान है।
टेप विधि द्वारा एक टीएमए के सफल समापन के लिए दो सिद्धांत मीट्रिक हैं। पहला अपेक्षित पदों पर ऊतक कोर डॉट्स की उपस्थिति है और एक दूसरे से अलग दूरी है, जिसका मूल्यांकन दृश्य निरीक्षण द्वारा किया जाता है। ए और बी में दिखाई गई छवियां दो सफलतापूर्वक पूर्ण टेप विधि टीएमए और संबंधित एच एंड ई स्लाइड को दर्शाती हैं।
इन टीएमए ब्लॉकों के दृश्य निरीक्षण से पता चलता है कि कोर मौजूद हैं और नियमित रूप से प्रत्येक टीएमए और उनके संबंधित वर्गों में स्थान रखते हैं। टेप विधि निर्माण प्रक्रिया के दौरान उत्पन्न होने वाले कुछ प्रमुख निर्माण मुद्दों में ठोसीकरण से पहले धातु के आधार को समय से पहले हटाने के कारण ब्लॉक और कैसेट का पृथक्करण शामिल है, जैसा कि छवि सी.कोर टॉपलिंग और / या एम्बेडेड कोर के प्लेसमेंट बहाव में दिखाया गया है जैसा कि छवि डी में दिखाया गया है, पिघले हुए पैराफिन के अत्यधिक अशांत डालने के दौरान हो सकता है, जो खराब चिपकने वाला डबल-साइडेड स्टिक टेप द्वारा खराब हो सकता है। यह आंकड़ा दिखाता है कि प्रत्येक कोर के लिए एच एंड ई दाग एक अनुकरणीय टीएमए है।
कोर स्पॉट में से एक को छोड़कर सभी एच एंड ई में मौजूद हैं। आंकड़ा यह भी दिखाता है कि कुछ कोर पूर्ण परिपत्र ऊतक बिंदुओं के रूप में मौजूद हैं, जबकि अन्य पूरी तरह से मौजूद नहीं हैं। इस तरह के ऊतक हानि असामान्य नहीं है और अपर्याप्त ब्लॉक के कारण हो सकता है जो सभी कोर को पूर्ण रूप से प्रकट करने के लिए सामना कर रहा है।
वैकल्पिक रूप से अपूर्ण की उपस्थिति या ऊतक की कुल अनुपस्थिति उस कोर की खराब ऊतक गुणवत्ता से स्टेम हो सकती है, जिसके परिणामस्वरूप धुंधला प्रक्रिया के दौरान ऊतक हानि हो सकती है। इस अगले आंकड़े में इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और आरएनए आईएसएच स्टेनिंग को टीएमए वर्गों पर आगे टीएमए को मान्य करने के लिए किया गया था। जैसा कि यहां दिखाया गया है, टीएमए के निर्माण के लिए उपयोग किए जाने वाले ऊतक के आधार पर विभिन्न प्रकार के दाग का उपयोग किया जा सकता है।
विमेंटिन का उपयोग गुणवत्ता नियंत्रण के रूप में किया जाता है। U6 आरएनए गुणवत्ता का एक संकेतक है। EBER का उपयोग EBV स्थिति निर्धारित करने के लिए किया जाता है।
और CD20 बी कोशिकाओं की उपस्थिति को इंगित करने के लिए एक बी-सेल मार्कर है। ये कुछ दाग हैं जिनका उपयोग आपके टीएमए को मान्य करने में मदद करने के लिए किया जा सकता है। इस वीडियो को देखने के बाद, आपको यह समझना चाहिए कि टेप विधि का उपयोग करके ऊतक माइक्रोएरे कैसे बनाया जाए और टीएमए महत्वपूर्ण समय और संसाधन-बचत अनुसंधान उपकरण क्यों हैं।
आपको यह भी समझना चाहिए कि टीएमए निर्माण एक आदर्श प्रक्रिया नहीं है और यह कि निरंतर पैथोलॉजिकल मार्गदर्शन और समीक्षा न केवल निर्माण प्रक्रिया के दौरान बल्कि टीएमए वर्गों पर किए गए इम्यूनोहिस्टोकेमिकल अध्ययनों के लिए भी महत्वपूर्ण घटक हैं ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि ब्याज का ऊतक वास्तव में टीएमए अनुभाग में मौजूद है।
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