Immunology and Infection
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Beredning av pärlstödda lipidbilayers för att studera partikelproduktionen av T-cells immunsynapser
Chapters
Summary April 1st, 2022
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Här presenterar vi protokollet för stegvis rekonstitution av syntetiska antigen-presentera celler med hjälp av pärla-stödda Lipid Bilayers och deras användning för att förhöra den synaptiska produktionen från aktiverade T-celler.
Transcript
Studien av produktionen av immunsynapsen har begränsats mestadels till mikroskopiska metoder. BSLBs har utökat vår repertoar av verktyg som kan användas för att studera produktionen av T-cells immunsynapser, inklusive flödescytometri, mikroskopi, proteomik och RNA-sekvenseringsteknik. Som sådan kan BSLBs användas i en mängd olika immunologi frågor och för att identifiera sammansättning och biokemisk reglering av T-cellsproduktionen.
Detta inkluderar till exempel studier av chimeriska antigenreceptorer, läkemedel som hämmar specifika signalvägar eller genetisk ablation av gener av intresse. En av de mest kritiska aspekterna av detta protokoll är att optimera proteinkalibreringarna och den flerfärgade flödescytometripanelen som krävs för att spåra den transsynaptiska partikeln av intresse. Detta kräver systematisk iteration av proteinkoncentrationer, antikroppskoncentrationer och instrumentinställningar.
Börja med att späda ut en mikroliter pärlalösning med 1 000 mikroliter PBS. Räkna pärlorna med hjälp av en hemocytometerkammare och beräkna deras koncentration per milliliter. Beräkna sedan volymen av kiselpärlor som behövs för 500 000 slutliga BSLBs per titreringspunkt.
Överför den erforderliga volymen kiseldioxidpärlor till ett sterilt 1,5-milliliter mikrocentrifugerör. Tvätta kiselpärlor tre gånger med en milliliter steril PBS och centrifugera pärlorna. Förbered tre volymer liposom master mix som innehåller en slutlig 12,5-mullvad procent av nickelhaltiga fosfolipider.
Använd den liposommästarblandningen för att återanvända de tvättade kiseldioxidpärlorna. Blanda sedan försiktigt det genom att pipettera upp och ner hälften av den totala volymen. Använd en steril teknik, tillsätt argon eller kvävegas till röret för att förskjuta luft och skydda lipiderna från oxidation under blandning.
Tillsätt argon till 0,4-millimolar lipidlagren. Förvara lagret och manipulera med en steril teknik. Flytta BSLB:erna till den vertikala blandaren och blanda i 30 minuter vid rumstemperatur med hjälp av orbitalblandning vid 10 VARV/min.
Snurra sedan ner pärlorna genom att centrifugera i 15 sekunder vid rumstemperatur på en bänk-topp minicentrifuge. Blockera de bildade BSLB: erna genom att tillsätta en milliliter på 5%BSA innehållande 100 mikromolar nickelsulfat för att mätta NTA-ställen på BSLBs. Tvätta tre gånger med HBS-HSA-buffert för att avlägsna den överflödiga blockeringslösningen.
Ta en ny U-botten eller V-botten 96-brunnsplatta och förbered tvåfaldiga seriella utspädningar av proteinerna. Återanslut de beredda BSLB:erna i en sådan volym att 100 mikroliter HBS-HSA-buffert innehåller 500 000 BSLB. Ta sedan en annan U-botten eller V-botten 96-brunnsplatta och överför 100 mikroliter av BSLB-suspensionen till brunnarna på ett sådant sätt att varje brunn får 500 000 BSBLs.
Snurra ner den andra plattan vid rumstemperatur i två minuter vid 300x G.Kassera supernatanten och överför 100 mikrolitervolymer från proteintitreringsplattan till plattan som innehåller sedimenterade BSLBs. Blanda försiktigt och undvik överskott av bubbelgenerering under pipettering. Använd aluminiumfolie för att skydda den mot ljus och inkubera vid rumstemperatur i 30 minuter vid 1 000 RPM.
Tvätta sedan plattan tre gånger genom att tillsätta HBS-HSA-buffert på plattan och snurra ner den i rumstemperatur i två minuter vid 300x G.Räkna cellerna efter tvätt. Späd dem sedan till en slutlig koncentration av 2,5 miljoner per milliliter med hjälp av synaptiskt överföringsanalysmedium. När BSLBs har laddats med proteinblandningen, tvätta BSLBs två gånger med HBS-HSA-bufferten för att avlägsna överskottet av obundna proteiner.
Återanvänd 500 000 BSLBs per brunn i 200 mikroliter HBS-HSA-buffert. Överför 100 mikroliter BSLB per brunn till en ny U-botten 96-brunnsplatta för att göra en dubblett, så att den slutliga mängden BSLB per brunn är 250 000. Snurra ner BSLBs vid 300x G i två minuter vid rumstemperatur.
Kassera supernatanten och återanvänd sedan BSLB:erna med 100 mikroliter T-cellsuspension. Blanda försiktigt för att förhindra bildandet av bubblor. Inkubera samkulturerna i 90 minuter vid 37 grader Celsius.
Skydda cellerna från ljus och kyla ner samkulturerna genom att först inkubera dem vid rumstemperatur i minst 15 minuter. Centrifugera samkulturerna i rumstemperatur i fem minuter vid 500x G.Kassera supernatanten och återanvänd samkulturerna i kalcium- och magnesiumjonfri 2%BSA PBS vid rumstemperatur för blockering. Placera cellerna på is i 45 minuter och skydda dem mot ljus.
Förbered antikroppsblandningen med iskall 0,22 mikrometerfiltrerad 2%BSA och PBS som färgbuffert. Denna huvudmix ger extra blockering. Snurra ner co-cultures på 500x G i fem minuter och fyra grader Celsius.
Kassera supernatanterna och använd sedan en flerkanalig pipett för att återanvända cellerna i färgningsmästareblandningen som innehåller optimerade antikroppskoncentrationer. Inkludera isotypmärkta celler och BSLBs, fluorescerande och icke-fluorescerande BSLBs och celler och BSLBs färgade ensamma. Blanda försiktigt genom pipettering upp och ner halva volymen.
Inkubera i 30 minuter på is och skydda dem från ljus. Tvätta cellerna och BSLBs två gånger med iskall 2%BSA PBS. Snurra ner dem vid 500x G i fem minuter vid fyra grader Celsius.
Efter centrifugering, kontrollera samkulturen sedimenterad på botten av brunnarna. Återanvänd sedan de tvättade co-kulturerna i 100 mikroliter PBS och förvärva omedelbart. Aktivera loggskalan för sidostrött ljus och flygtidsparametern för sido- och framåtst utspritt ljus.
Förvärva MESF-standarder, vilket säkerställer att både de dim-set och ljusaste populationerna faller i instrumentets linjära intervall. Skaffa sedan kompensationsprover, beräkna kompensation och tillämpa kompensationsmatrisen på experimentet. Skaffa och spara minst 20 000 MESF-standarder totalt för varje kvantifieringskanal.
Undvik att använda FACS mantlar eller liknande resuspend MESF pärlor, eftersom dessa innehåller salter och alkoholer som kommer att förstöra fluorokromerna, vilket leder till bredare fluorescenstoppar och höga fel. För förvärv med hög genomströmningsprovtagare, ställ in instrumentförvärv till standard, ställ in provförvärv till 80 mikroliter. Provflödeshastighet mellan två och tre mikroliter per sekund, provblandningsvolym vid 50 mikroliter, provblandning av 150 mikroliter per sekund och blandning per brunn mellan tre och fem.
Skaffa minst 10 000 BSLB per prov. Exportera slutligen FCS-filerna. Ett exempel på kvantitativa flöde cytometri mätningar av ICAM-1 på ytan av tonsillar B celler och hjälpare T-celler visas här.
De representativa bilderna beskriver gating strategi för att analysera enstaka CXCR5 B celler och follicular-helper T celler isolerade från mänskliga palatine tonsiller. Den här sekventiella gating-strategin identifierar enskilda livehändelser i det kontinuerliga förvärvsfönstret. Doublets, cellytan uttryck av ICAM-1 jämfört med FMO kontroller och FMO kontroller märkta med relevanta isotyper av populationerna, visas här.
Gating och mätning av MFI från olika standard MESF populationer i överlagrade histogram av MESF populationer visas här. Värdena representerar MFI för var och en av de fem MESF-populationerna. Linjär regression av MESF över cMFI för MESF populationer presenteras här.
Lutningen extraherar MESF bunden till celler från FCM data av ICAM-1 på ytan av tonsiller B celler i TFH. Omvandlingen till absoluta molekylära densiteter följer dessa enkla matematiska operationer. De representativa bilderna visar flöde cytometry analys av BSLBs rekonstituerade med ökad densitet av rekombinant monomeric ICAM-1 12 histidiner.
Regressionsanalyser av ICAM-1 referenskoncentration över uppmätt densitet visas här. Lutningen används för att beräkna målkoncentrationer av protein för att uppnå cellernas densitet. Flödesdiagrammen visar de kritiska stegen för samodling av T-celler med BSLB, rekonstituera modellmembran i efterföljande mätning av partikelöverföring med flödescytometri.
Gating-strategin för att identifiera enskilda BSLB och celler i fönstret för kontinuerlig anskaffning visas här. En av de viktigaste aspekterna av detta protokoll är att för att upprätthålla reproducerbarheten av resultaten, varje gång du byter protein- eller lipidlager, måste du utföra ny kalibreringsanalys. För att upptäcka nya effektiva molekyler som utsöndras av olika T-cellsundergrupper kan BSLBs isoleras ytterligare genom fluorescensaktiverad cellsortering som utsätts för transkriptomisk och proteomisk analys.
Våra kollegor vid University of Oxford har använt denna teknik för att studera och demonstrera nya receptor-ligand interaktioner, och även för att studera effekterna av genetiska ablationer på produktionen av T-cellen immunsynaps.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
