Immunology and Infection
This content is Free Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Detectie van neutralisatiegevoelige epitopen in antigenen die worden weergegeven op op virusachtige deeltjes (VLP) gebaseerde vaccins met behulp van een capture-assay
Chapters
Summary February 10th, 2022
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Hier presenteren we een protocol om neutralisatie-epitopen te detecteren op antigeen-displaying virusachtige deeltjes (VLP's). Immunoprecipitatie van het van het humaan immunodeficiëntievirus (HIV) afgeleide VLP's wordt uitgevoerd met behulp van envelop glycoproteïnen-specifieke monoklonale antilichamen gekoppeld aan eiwit G-geconjugeerde magnetische kralen. Gevangen VLP's worden vervolgens onderworpen aan SDS-PAGE en Western blot-analyse met behulp van virale kerneiwit Gag-specifieke antilichamen.
Transcript
In mijn lab ontwikkelen we productiesystemen voor virale vectoren en virusachtige deeltjes, of op VLP gebaseerde vaccins. De VLP-capture-test maakt de zeer gevoelige detectie van doelantigenen op VLP's mogelijk. In deze test gebruiken we breed neutraliserende antilichamen gericht tegen neutralisatie-epitopen om de blootstelling van deze epitopen op het VLP-oppervlak te bewijzen.
Dit is een belangrijke kwaliteitsbeoordeling voor vaccinkandidaten, omdat alleen VLP's met neutralisatiegevoelige epitopen in staat zullen zijn om een neutraliserende antilichaamrespons bij gevaccineerden uit te lokken. Begin met het ophangen van de magnetische kralen door op en neer te pipetteren of gedurende ten minste vijf minuten op een rotator met 50 RPM te mengen. Bereid ondertussen de antilichaamoplossing voor die de bNABs bevat.
Gebruik 10 microgram van elke bNAB in 200 microliter antilichaambinding en wasbuffer per reactie. Breng voor elke reactie 50 microliter van de magnetische kraaloplossing over in een reactiebuis van 1,5 milliliter en plaats de buizen vervolgens op het magnetische scheidingsrek. Wacht tot de kralen zich verzamelen bij de buisbal om ervoor te zorgen dat alle kralen zijn verzameld en verwijder vervolgens het supernatant.
Verwijder de magneet en hang de kralen op in 200 microliter van de eerder bereide bNAB-oplossing. Incubeer gedurende 30 minuten tot drie uur tijdens het mengen op een rotator bij 50 RPM bij kamertemperatuur. Plaats na de incubatie de reactiebuizen in het magnetisch scheidingsrek, wacht en verwijder het supernatant.
Verwijder de buisjes van de magneet en was de kralen door opnieuw in 200 microliter antilichaambinding en wasbuffer te hangen. Herhaal de was met antilichaambinding en wasbuffer en verwijder zoveel mogelijk wasbuffer als je klaar bent. Voeg de monsters toe aan de kralengebonden bNABs.
Als het toegevoegde monstervolume kleiner is dan één milliliter, voegt u PBS toe om het monstervolume aan te passen aan één milliliter en suspenseert u de kralen opnieuw door voorzichtig te pipetteren. Incubeer de monsters en kralen gedurende 2,5 uur op een rotator bij kamertemperatuur, zorg ervoor dat de kralen in suspensie blijven en de oplossing grondig wordt gemengd tijdens de incubatie. Plaats de buizen op de magneet en verwijder het supernatant en was vervolgens de magnetische kralen door ze in 200 microliter wasbuffer op te hangen.
Hang de kralen op in 100 microliter wasbuffer en breng de suspensie over naar een schone, hittebestendige reactiebuis. Plaats de buis op het magnetisch scheidingsrek en verwijder het supernatant volledig. Om gedenatureerde STS-PAGE-monsters te bereiden, suspensuur je de kralen in 20 tot 80 microliter Laemmli-buffer en incubeer je gedurende vijf minuten bij 95 graden Celsius.
Ga direct verder met SDS-PAGE en plaats de buizen op een magnetisch rek om de kralen van de oplossing te scheiden. U kunt de monsters ook bewaren bij min 20 graden Celsius. Een representatieve uitkomst van VLP's die voor het eerst werden gevangen uit celvrije celkweeksupernatant- en VLP-pellets met behulp van bNABs, en vervolgens werden onderworpen aan Western blot-analyse om virale kerneiwitten te detecteren, wordt hier getoond.
De kralen die werden gebruikt voor de vangsttest waren bedekt met drie verschillende bNABs gericht tegen neutralisatie-epitopen van de envelop glycoproteïnen en isotype-antilichamen die als negatieve controles dienden. Met behulp van met isotoopantilichamen gecoate kralen waren geen Gag-eiwitten detecteerbaar in VLP-monsters die kale VLP's bevatten, dat wil zeggen Env-negatieve VLP's of Env-weergevende VLP's, wat aantoont dat de niet-specifieke binding van VLP's aan kralen bedekt met menselijke antilichamen VLP-vangst niet bemiddelde. Kale VLP's waren ook niet gebonden aan met bNABs gecoate kralen, en bijgevolg waren er geen Gag-eiwitten detecteerbaar in de Western blot-analyse.
Daarentegen werden alle drie de bNABs VLP's met Env-eiwitten vastgelegd, daarom werden Gag-eiwitten gemakkelijk gedetecteerd, wat de aanwezigheid van neutralisatie-epitopen aantoonde in de Env-glycoproteïnen die op VLP's werden weergegeven. Cruciaal voor het succes van de test: een grondige vermenging van VLP's met antilichaam-gecoate kralen. Dit kan het beste worden bereikt met volumes groter dan 500 microliter onder rotatie.
Als alternatief kunnen gevangen VLP's worden geëlueerd onder niet-reducerende omstandigheden. Dit maakt de analyse van VLP's met behulp van immuno-elektronenmicroscopie mogelijk, of het onderzoek van de weergegeven antigenen met behulp van native PAGE.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
