एंटीजन में न्यूट्रलाइजेशन-संवेदनशील एपिटोप का पता लगाना वायरस की तरह कण (वीएलपी) पर प्रदर्शित- एक कैप्चर परख का उपयोग करके आधारित टीके

मेरी प्रयोगशाला में, हम वायरल वैक्टर और वायरस जैसे कण, या वीएलपी-आधारित टीकों के लिए उत्पादन प्रणाली विकसित करते हैं। वीएलपी कैप्चर परख वीएलपी पर प्रदर्शित लक्ष्य एंटीजन का बहुत संवेदनशील पता लगाने के लिए अनुमति देता है। इस परख में, हम मोटे तौर पर बेअसर एंटीबॉडी का उपयोग करने के लिए VLP सतह पर इन epitopes के जोखिम को साबित करने के लिए neutralization epitopes के खिलाफ निर्देशित.

यह वैक्सीन उम्मीदवारों के लिए एक महत्वपूर्ण गुणवत्ता मूल्यांकन है, क्योंकि केवल न्यूट्रलाइजेशन-संवेदनशील एपिटोप प्रदर्शित करने वाले वीएलपी टीके में एक बेअसर एंटीबॉडी प्रतिक्रिया प्राप्त करने में सक्षम होंगे। चुंबकीय मोतियों को निलंबित करके या तो ऊपर और नीचे पाइपिंग करके शुरू करें, या कम से कम पांच मिनट के लिए 50 आरपीएम पर रोटेटर पर मिश्रण करें। इस बीच, बीएनएबी युक्त एंटीबॉडी समाधान तैयार करें।

एंटीबॉडी बाइंडिंग के 200 माइक्रोलीटर में प्रत्येक बीएनएबी के 10 माइक्रोग्राम का उपयोग करें और प्रति प्रतिक्रिया बफर धोएं। प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए, चुंबकीय मनका समाधान के 50 माइक्रोलीटर को 1.5-मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूब में स्थानांतरित करें, फिर ट्यूबों को चुंबकीय पृथक्करण रैक पर रखें। तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि मोती ट्यूब बॉल पर इकट्ठा न हो जाएं ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि सभी मोतियों को एकत्र किया जाता है, फिर supernatant को हटा दें।

चुंबक को निकालें और पहले से तैयार bNAB समाधान के 200 माइक्रोलीटर में मोतियों को निलंबित करें। कमरे के तापमान पर 50 आरपीएम पर एक रोटेटर पर मिश्रण करते समय 30 मिनट से तीन घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के बाद, चुंबकीय पृथक्करण रैक में प्रतिक्रिया ट्यूबों को रखें, प्रतीक्षा करें, और supernatant को हटा दें।

चुंबक से ट्यूबों को निकालें और एंटीबॉडी बाइंडिंग और धोने बफर के 200 माइक्रोलीटर में फिर से निलंबित करके मोतियों को धोएं। एंटीबॉडी बाइंडिंग और वॉशिंग बफर के साथ धोने को दोहराएं, समाप्त होने पर जितना संभव हो उतना वॉशिंग बफर को हटा दें। मनका-बाउंड bNABs करने के लिए नमूने जोड़ें।

यदि जोड़ा गया नमूना वॉल्यूम एक मिलीलीटर से नीचे है, तो नमूना मात्रा को एक मिलीलीटर में समायोजित करने के लिए पीबीएस जोड़ें, फिर धीरे से पिपेटिंग करके मोतियों को फिर से निलंबित करें। कमरे के तापमान पर रोटेटर पर 2.5 घंटे के लिए नमूनों और मोतियों को इनक्यूबेट करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि मोती निलंबन में रहें और समाधान इनक्यूबेशन दौरान पूरी तरह से मिश्रित हो। चुंबक पर ट्यूबों को रखें और supernatant को हटा दें, फिर उन्हें धोने के बफर के 200 माइक्रोलीटर में निलंबित करके चुंबकीय मोतियों को धोएं।

धोने के बफर के 100 माइक्रोलीटर में मोतियों को निलंबित करें और निलंबन को एक साफ, गर्मी प्रतिरोधी प्रतिक्रिया ट्यूब में स्थानांतरित करें। चुंबकीय पृथक्करण रैक पर ट्यूब जगह और supernatant पूरी तरह से हटाने. विकृत एसटीएस-पेज के नमूने तैयार करने के लिए, लैमली बफर के 20 से 80 माइक्रोलीटर में मोतियों को निलंबित करें और पांच मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।

एसडीएस-पेज के साथ सीधे आगे बढ़ें, समाधान से मोतियों को अलग करने के लिए एक चुंबकीय रैक पर ट्यूबों को रखें। वैकल्पिक रूप से, नमूनों को माइनस 20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। वीएलपी का एक प्रतिनिधि परिणाम पहले बीएनएबी का उपयोग करके सेल-मुक्त सेल संस्कृति supernatant और VLP छर्रों से कब्जा कर लिया गया था, और बाद में वायरल कोर प्रोटीन का पता लगाने के लिए पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के अधीन, यहां दिखाया गया है।

कैप्चर परख के लिए इस्तेमाल किए जाने वाले मोतियों को लिफाफा ग्लाइकोप्रोटीन और नकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवारत आइसोटाइप एंटीबॉडी के न्यूट्रलाइजेशन एपिटोप के खिलाफ निर्देशित तीन अलग-अलग बीएनएबी के साथ लेपित किया गया था। आइसोटोप एंटीबॉडी-लेपित मोतियों का उपयोग करते हुए, गंजे वीएलपी वाले नमूनों में कोई गैग प्रोटीन का पता लगाने योग्य नहीं था, अर्थात्, एनवी-नकारात्मक वीएलपी, या एनवी-प्रदर्शित वीएलपी, यह प्रदर्शित करते हुए कि मानव एंटीबॉडी के साथ लेपित मोतियों के लिए वीएलपी के अनिर्दिष्ट बंधन ने वीएलपी कैप्चर की मध्यस्थता नहीं की थी। गंजा वीएलपी भी बीएनएबी-लेपित मोतियों से बाध्य नहीं थे, और नतीजतन, पश्चिमी धब्बा विश्लेषण में कोई गैग प्रोटीन पता लगाने योग्य नहीं था।

इसके विपरीत, सभी तीन बीएनएबी ने एनवी-प्रोटीन प्रदर्शित करने वाले वीएलपी पर कब्जा कर लिया, इसलिए, गैग प्रोटीन को आसानी से पता लगाया गया, जो वीएलपी पर प्रदर्शित एनवी-ग्लाइकोप्रोटीन में न्यूट्रलाइजेशन एपिटोप की उपस्थिति का प्रदर्शन करता है। परख की सफलता के लिए महत्वपूर्ण: एंटीबॉडी-लेपित मोतियों के साथ वीएलपी का एक संपूर्ण मिश्रण। यह रोटेशन के तहत 500 माइक्रोलीटर से बड़े वॉल्यूम का उपयोग करके सबसे अच्छा हासिल किया जाता है।

वैकल्पिक रूप से, कैप्चर किए गए वीएलपी को गैर-कम करने वाली परिस्थितियों में अलग किया जा सकता है। यह इम्यूनो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी को नियोजित करने वाले वीएलपी के विश्लेषण, या देशी पेज का उपयोग करके प्रदर्शित एंटीजन की जांच को सक्षम बनाता है।