Please note that all translations are automatically generated.
Her presenterer vi en protokoll for å oppdage nøytraliseringsepiller på antigen-viser viruslignende partikler (VLPer). Immunoprecipitation av det humane immunsviktviruset (HIV)-avledede VLPer utføres ved hjelp av konvoluttglykoproteiner-spesifikke monoklonale antistoffer kombinert med protein G-konjugerte magnetiske perler. Fangede VLPer blir deretter utsatt for SDS-PAGE og vestlig blot-analyse ved hjelp av viral kjerneprotein Gag-spesifikke antistoffer.
I laboratoriet mitt utvikler vi produksjonssystemer for virale vektorer og viruslignende partikkel- eller VLP-baserte vaksiner. VLP-opptaksanalysen muliggjør svært sensitiv deteksjon av målantigener som vises på VIP-er. I denne analysen bruker vi bredt nøytraliserende antistoffer rettet mot nøytraliseringsepiller for å bevise eksponeringen av disse epitopene på VLP-overflaten.
Dette er en viktig kvalitetsvurdering for vaksinekandidater, da bare VIP-er som viser nøytraliseringssensitive epitoper vil kunne fremkalle en nøytraliserende antistoffrespons hos vaksiner. Begynn med å suspendere de magnetiske perlene enten ved å pipettere opp og ned, eller bland på en rotator ved 50 RPM i minst fem minutter. I mellomtiden, forbered antistoffløsningen som inneholder bNAB-ene.
Bruk 10 mikrogram av hver bNAB i 200 mikroliter antistoffbinding og vaskebuffer per reaksjon. For hver reaksjon, overfør 50 mikroliter av den magnetiske perleoppløsningen til et 1,5 milliliter reaksjonsrør, og plasser deretter rørene på det magnetiske separasjonsstativet. Vent til perlene samles på rørkulen for å sikre at alle perler samles, og fjern deretter supernatanten.
Fjern magneten og suspender perlene i 200 mikroliter av den tidligere tilberedte bNAB-løsningen. Inkuber i 30 minutter til tre timer mens du blander på en rotator ved 50 RPM ved romtemperatur. Etter inkubasjonen plasserer du reaksjonsrørene i det magnetiske separasjonsstativet, venter og fjerner supernatanten.
Fjern rørene fra magneten og vask perlene ved å suspendere i 200 mikroliter antistoffbinding og vaskebuffer. Gjenta vasken med antistoffbinding og vaskebuffer, og fjern så mye vaskebuffer som mulig når du er ferdig. Legg til eksemplene i de perlebundne bNAB-ene.
Hvis det ekstra prøvevolumet er under en milliliter, legger du til PBS for å justere prøvevolumet til en milliliter, og deretter suspendere perlene forsiktig ved å pipettere forsiktig. Inkuber prøvene og perlene i 2,5 timer på en rotator ved romtemperatur, sørg for at perlene forblir i suspensjon og løsningen blandes grundig under inkubasjon. Plasser rørene på magneten og fjern supernatanten, vask deretter de magnetiske perlene ved å suspendere dem i 200 mikroliter vaskebuffer.
Suspender perlene i 100 mikroliter vaskebuffer og overfør suspensjonen til et rent, varmebestandig reaksjonsrør. Plasser røret på det magnetiske separasjonsstativet og fjern supernatanten helt. For å forberede denaturerte STS-PAGE-prøver, suspendere perlene i 20 til 80 mikroliter laemmli buffer og inkubere ved 95 grader Celsius i fem minutter.
Fortsett direkte med SDS-PAGE, plasser rørene på et magnetisk stativ for å skille perlene fra løsningen. Alternativt kan du lagre prøvene på minus 20 grader Celsius. Et representativt resultat av VIP-er som først ble fanget opp fra cellefrie cellekultur supernatant- og VLP-pellets ved hjelp av bNABer, og deretter utsatt for vestlig blotanalyse for å oppdage virale kjerneproteiner, vises her.
Perlene som ble brukt til fangstanalysen ble belagt med tre forskjellige bNABer rettet mot nøytraliseringsepiller av konvoluttglykoproteiner og isotypeantistoffer som tjener som negative kontroller. Ved hjelp av isotop antistoffbelagte perler var ingen Gag-proteiner påvisbare i VLP-prøver som inneholder skallede VIP-er, det vil være Env-negative VLPer, eller Env-viser VLPer, som viser at den uspesifiserte bindingen av VIP-er til perler belagt med menneskelige antistoffer ikke formidler VLP-fangst. Skallede VIP-er var heller ikke bundet av bNABs-belagte perler, og følgelig var ingen Gag-proteiner påvisbare i den vestlige blotanalysen.
I motsetning til dette ble alle tre bNAB-ene fanget VLPer som viste Env-proteiner, derfor ble Gag-proteiner lett oppdaget, noe som demonstrerer tilstedeværelsen av nøytraliseringsepioper i Env-glykoproteinene som vises på VLPer. Avgjørende for suksessen til analysen: en grundig blanding av VLPer med antistoffbelagte perler. Dette oppnås best ved hjelp av volumer som er større enn 500 mikroliter under rotasjon.
Alternativt kan fangede VIP-er unngås under ikke-reduserende forhold. Dette muliggjør analyse av VLPer som bruker immuno-elektronmikroskopi, eller undersøkelse av de viste antigenene ved hjelp av innfødt SIDE.
