Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Isoler celletypespesifikke RNAer fra snapfrosne heterogene vevsprøver uten cellesortering
Chapters
Summary December 8th, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Denne protokollen tar sikte på å isolere celletypespesifikke oversette ribosomale mRNA ved hjelp av NuTRAP-musemodellen.
Transcript
Denne protokollen tar sikte på å oppnå høy kvalitet celletyper spesifikke RNA fra et lite antall celler i et komplekst vev uten cellesortering. Den bruker en nylig tilgjengelig musemodell som gjør det mulig for forskere å isolere et ribosombundet RNA ved hjelp av GLP-nedtrekk. Metoden er også egnet for å isolere ribosombundne RNA fra alle EGFP-uttrykkende celler.
For å begynne med, legg til to milliliter iskald homogeniseringsarbeidsbuffer til et glassvevkvernsett. Legg den frosne prøven raskt i kvernen og homogeniser vevet med 30 slag på is ved hjelp av en løs pestle. Overfør homogenatet til et to milliliter rundbunnsrør og sentrifuger ved 12.000 g i 10 minutter ved fire grader Celsius.
Overfør deretter supernatanten til et nytt to milliliter rør uten å forstyrre pelleten, og reserver 100 mikroliter som inngang. Inkuber supernatanten med anti-GFP-antistoffet ved fire grader Celsius på en ende over ende rotator over natten. Overfør homogenat- og antistoffblandingen til et nytt to milliliter rundbunnsrør som inneholder vasket protein g-perler og inkuberes fire grader Celsius på rotator ved 24 o / min i to timer.
Skill de magnetiske perlene fra supernatanten ved hjelp av et magnetisk stativ. Lagre supernatanten som den negative fraksjonen som inneholder RNA i EGFP-negative celler og RNA i EGFP-positive celler som ikke er bundet til ribosomer. Tilsett en milliliter høy saltvaskbuffer til perlene og vortex kort røret for å vaske perlene.
Plasser deretter røret i et magnetisk stativ. Fjern vaskebufferen og gjenta vasketrinnene to ganger til for å oppnå perlene ribosom-RNA-komplekset fra EGFP-positive celler. Inkuber perlene med 50 mikroliter ekstraksjonsbuffer fra RNA-isolasjonssettet i en ThermoMixer i 30 minutter for å frigjøre RNA fra perlene.
Skill perlene med et magnetisk stativ og overfør supernatanten til et 1,5 milliliter rør. Sentrifuge røret ved 3000 g i to minutter. Pipetter deretter supernatanten til et nytt 1,5 milliliter rør.
For å forhåndskondisjonere RNA-rensingskolonnen, pipetter 250 mikroliter kondisjoneringsbuffer på rensekolonnen og inkuberes i fem minutter ved romtemperatur. Sentrifuger deretter kolonnen ved 16.000 g i ett minutt. Pipette et likt volum av 70% etanol inn i celleekstraktet og bland godt ved pipettering.
Pipette opptil 200 mikroliter av blandingen inn i den forutbestemte RNA-rensingskolonnen. Hvis du vil redusere tapet av prøver, må du ikke fylle kolonnen mer enn 80 % av kapasiteten. Gjenta dette trinnet flere ganger til alle RNA er samlet i samme kolonne i hver fraksjon.
Sentrifuge kolonnen i to minutter for å binde RNA til membranen i kolonnen. Fortsett deretter sentrifugering i 30 sekunder. Kast gjennomstrømningen og pipett 100 mikroliter vaskebuffer en inn i kolonnen.
Sentrifuge i ett minutt, og kast deretter gjennomstrømningen. Pipette 75 mikroliter DNA-løsning blandes direkte inn i rensekolonnemembranen. Inkuber ved romtemperatur i 15 minutter.
Deretter pipetter 40 mikroliter vaskebuffer en inn i kolonnen og sentrifugen i ytterligere 30 sekunder. Kast gjennomstrømningen. Pipette 100 mikroliter vaskebuffer to inn i kolonnen og sentrifugen ved 8.000 g i ett minutt.
Kast gjennomstrømningen. Kjøp PET 100 mikroliter vaskebuffer to i kolonnen og sentrifuge ved 16.000 g i to minutter. Kast gjennomstrømningen, og sentrifuger den samme kolonnen ved 16.000 g i ett minutt for å fjerne alle spor av vaskebuffer.
Overfør kolonnen til et nytt 1,5 milliliter mikrosentrifugerør. pipette 12 mikroliter RNasefritt vann direkte på membranen i rensekolonnen, slik at pipettespissen ikke berører membranen. Inkuber ved romtemperatur i ett minutt og sentrifuger ved 1000 g i ett minutt.
Deretter ved 16.000 G i ett minutt for å eluere RNA. Bruk en bioanalysator for å vurdere kvaliteten og mengden av det ekstraherte RNA. Oppbevar RNA i en 80 graders fryser eller send ut for videre analyse.
Mus som bærer både genmodifiserte genalleler, Gli1-CreERT2 og NuTRAP, blir injisert med tamoxifen en gang om dagen, annenhver dag for tre injeksjoner. Immunfluorescensanalyse av oppsamlet vev viser at EGFP ble uttrykt i interstitielle celler i testiklene. EGFP ble også funnet i binyrene capsulære celler i Gli1-CreERT2, NuTRAP mus.
I Sonic Hedgehog-CreERT2, NuTRAP-mus Den EGFP-positive cellepopulasjonen ligger i den ytre cortex av binyrene under kapselen, og bekrefter uttrykket av EGFP-foruttrykkende celler. Etter ekstraksjonen av celletypespesifikke RNAer ble det ekstraherte RNA sendt til mikroarray-analyse. Resultatene viste at ca. 3000 gener var beriket i den positive fraksjonen, sammenlignet med gener i den negative fraksjonen, mens ca. 4000 gener ble beriket i den negative fraksjonen.
Blant de differensialuttrykte genene ble Leydig-celleassosierte gener Hsd11b1 og Hsd3b6 beriket i den positive fraksjonen. I den negative fraksjonen ble de Sertoli-celleassosierte genene Desert Hedgehog og Gstm6 beriket. Bare noen få differensielt uttrykte gener ble identifisert ved å sammenligne den negative fraksjonen med inngangen.
Realtime kvantitativ RT-PCR ble brukt til å bekrefte uttrykket av nøkkelgener i de positive og negative fraksjonene. I likhet med det som ble funnet i mikromatriseanalysen, ble steroidogene enzymer 3-beta hydroksysteroid dehydrogenase og kolesterol sidekjede spaltningsenzym beriket i den positive fraksjonen. I mellomtiden ble Sertoli-cellemarkøren SRY-bokstranskripsjonsfaktor ni og kimcellemarkøren synaptonemal komplekst protein tre beriket i den negative fraksjonen.
Når du prøver denne protokollen, er det viktig å forberede fersk homogeniseringsarbeidsbuffer Tilsett DTT, cykloheksimid rekombinant ribonuklease og proteinaseinhibitorcocktail til homogeniseringsstamløsningen bare før bruk. Det er også viktig å tilberede ferske lavsalt- og høysaltvaskebuffere før bruk.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
