2,043 Views
•
08:30 min
•
December 08, 2021
DOI:
Denne protokollen tar sikte på å oppnå høy kvalitet celletyper spesifikke RNA fra et lite antall celler i et komplekst vev uten cellesortering. Den bruker en nylig tilgjengelig musemodell som gjør det mulig for forskere å isolere et ribosombundet RNA ved hjelp av GLP-nedtrekk. Metoden er også egnet for å isolere ribosombundne RNA fra alle EGFP-uttrykkende celler.
For å begynne med, legg til to milliliter iskald homogeniseringsarbeidsbuffer til et glassvevkvernsett. Legg den frosne prøven raskt i kvernen og homogeniser vevet med 30 slag på is ved hjelp av en løs pestle. Overfør homogenatet til et to milliliter rundbunnsrør og sentrifuger ved 12.000 g i 10 minutter ved fire grader Celsius.
Overfør deretter supernatanten til et nytt to milliliter rør uten å forstyrre pelleten, og reserver 100 mikroliter som inngang. Inkuber supernatanten med anti-GFP-antistoffet ved fire grader Celsius på en ende over ende rotator over natten. Overfør homogenat- og antistoffblandingen til et nytt to milliliter rundbunnsrør som inneholder vasket protein g-perler og inkuberes fire grader Celsius på rotator ved 24 o / min i to timer.
Skill de magnetiske perlene fra supernatanten ved hjelp av et magnetisk stativ. Lagre supernatanten som den negative fraksjonen som inneholder RNA i EGFP-negative celler og RNA i EGFP-positive celler som ikke er bundet til ribosomer. Tilsett en milliliter høy saltvaskbuffer til perlene og vortex kort røret for å vaske perlene.
Plasser deretter røret i et magnetisk stativ. Fjern vaskebufferen og gjenta vasketrinnene to ganger til for å oppnå perlene ribosom-RNA-komplekset fra EGFP-positive celler. Inkuber perlene med 50 mikroliter ekstraksjonsbuffer fra RNA-isolasjonssettet i en ThermoMixer i 30 minutter for å frigjøre RNA fra perlene.
Skill perlene med et magnetisk stativ og overfør supernatanten til et 1,5 milliliter rør. Sentrifuge røret ved 3000 g i to minutter. Pipetter deretter supernatanten til et nytt 1,5 milliliter rør.
For å forhåndskondisjonere RNA-rensingskolonnen, pipetter 250 mikroliter kondisjoneringsbuffer på rensekolonnen og inkuberes i fem minutter ved romtemperatur. Sentrifuger deretter kolonnen ved 16.000 g i ett minutt. Pipette et likt volum av 70% etanol inn i celleekstraktet og bland godt ved pipettering.
Pipette opptil 200 mikroliter av blandingen inn i den forutbestemte RNA-rensingskolonnen. Hvis du vil redusere tapet av prøver, må du ikke fylle kolonnen mer enn 80 % av kapasiteten. Gjenta dette trinnet flere ganger til alle RNA er samlet i samme kolonne i hver fraksjon.
Sentrifuge kolonnen i to minutter for å binde RNA til membranen i kolonnen. Fortsett deretter sentrifugering i 30 sekunder. Kast gjennomstrømningen og pipett 100 mikroliter vaskebuffer en inn i kolonnen.
Sentrifuge i ett minutt, og kast deretter gjennomstrømningen. Pipette 75 mikroliter DNA-løsning blandes direkte inn i rensekolonnemembranen. Inkuber ved romtemperatur i 15 minutter.
Deretter pipetter 40 mikroliter vaskebuffer en inn i kolonnen og sentrifugen i ytterligere 30 sekunder. Kast gjennomstrømningen. Pipette 100 mikroliter vaskebuffer to inn i kolonnen og sentrifugen ved 8.000 g i ett minutt.
Kast gjennomstrømningen. Kjøp PET 100 mikroliter vaskebuffer to i kolonnen og sentrifuge ved 16.000 g i to minutter. Kast gjennomstrømningen, og sentrifuger den samme kolonnen ved 16.000 g i ett minutt for å fjerne alle spor av vaskebuffer.
Overfør kolonnen til et nytt 1,5 milliliter mikrosentrifugerør. pipette 12 mikroliter RNasefritt vann direkte på membranen i rensekolonnen, slik at pipettespissen ikke berører membranen. Inkuber ved romtemperatur i ett minutt og sentrifuger ved 1000 g i ett minutt.
Deretter ved 16.000 G i ett minutt for å eluere RNA. Bruk en bioanalysator for å vurdere kvaliteten og mengden av det ekstraherte RNA. Oppbevar RNA i en 80 graders fryser eller send ut for videre analyse.
Mus som bærer både genmodifiserte genalleler, Gli1-CreERT2 og NuTRAP, blir injisert med tamoxifen en gang om dagen, annenhver dag for tre injeksjoner. Immunfluorescensanalyse av oppsamlet vev viser at EGFP ble uttrykt i interstitielle celler i testiklene. EGFP ble også funnet i binyrene capsulære celler i Gli1-CreERT2, NuTRAP mus.
I Sonic Hedgehog-CreERT2, NuTRAP-mus Den EGFP-positive cellepopulasjonen ligger i den ytre cortex av binyrene under kapselen, og bekrefter uttrykket av EGFP-foruttrykkende celler. Etter ekstraksjonen av celletypespesifikke RNAer ble det ekstraherte RNA sendt til mikroarray-analyse. Resultatene viste at ca. 3000 gener var beriket i den positive fraksjonen, sammenlignet med gener i den negative fraksjonen, mens ca. 4000 gener ble beriket i den negative fraksjonen.
Blant de differensialuttrykte genene ble Leydig-celleassosierte gener Hsd11b1 og Hsd3b6 beriket i den positive fraksjonen. I den negative fraksjonen ble de Sertoli-celleassosierte genene Desert Hedgehog og Gstm6 beriket. Bare noen få differensielt uttrykte gener ble identifisert ved å sammenligne den negative fraksjonen med inngangen.
Realtime kvantitativ RT-PCR ble brukt til å bekrefte uttrykket av nøkkelgener i de positive og negative fraksjonene. I likhet med det som ble funnet i mikromatriseanalysen, ble steroidogene enzymer 3-beta hydroksysteroid dehydrogenase og kolesterol sidekjede spaltningsenzym beriket i den positive fraksjonen. I mellomtiden ble Sertoli-cellemarkøren SRY-bokstranskripsjonsfaktor ni og kimcellemarkøren synaptonemal komplekst protein tre beriket i den negative fraksjonen.
Når du prøver denne protokollen, er det viktig å forberede fersk homogeniseringsarbeidsbuffer Tilsett DTT, cykloheksimid rekombinant ribonuklease og proteinaseinhibitorcocktail til homogeniseringsstamløsningen bare før bruk. Det er også viktig å tilberede ferske lavsalt- og høysaltvaskebuffere før bruk.
Denne protokollen tar sikte på å isolere celletypespesifikke oversette ribosomale mRNA ved hjelp av NuTRAP-musemodellen.
Read Article
Cite this Article
Zheng, H. S., Huang, C. J. Isolate Cell-Type-Specific RNAs from Snap-Frozen Heterogeneous Tissue Samples without Cell Sorting. J. Vis. Exp. (178), e63143, doi:10.3791/63143 (2021).
Copy