Mätning av cellkantsutsprångsdynamik under spridning med hjälp av livecellmikroskopi

Cellkantsutskjutningsanalysen har visat sig direkt korrelera med cellmigration. Därför kan den användas som en preliminär metod för att identifiera kritiska proteiner och signalmekanismer som är involverade i cellmotilitet. Metoden är snabb, enkel, kostnadseffektiv och kräver inte fluorescerande märkning eller användning av ett dyrt fluorescerande mikroskop.

Demonstrerar proceduren kommer att vara Michal Gendler, en student från mitt laboratorium. Tillsätt två milliliter av en normal saltsyralösning i mitten av en glasskål och inkubera i 20 minuter vid rumstemperatur. Tvätta skålen tre gånger med två milliliter PBS.

Späd fibronektin vid 10 mikrogram per milliliter koncentration i PBS och tillsätt 200 mikroliter av den utspädda lösningen till glasskålen. Inkubera i en timme vid 37 grader Celsius. Förbered 1% BSA-lösning och PBS och passera den genom ett 0,2 mikrometerfilter.

Denaturera lösningen genom att inkubera vid 70 grader Celsius i 30 minuter i ett förvärmt vattenbad. Tvätta den belagda glasbottenskålen med två milliliter PBS tre gånger. Tillsätt två milliliter denaturerad BSA-lösning och inkubera skålen vid 37 grader Celsius i en timme.

Tvätta glasskålen med två milliliter PBS tre gånger. Före 16 till 18 timmars experiment vid 0,7 miljoner celler per 10 centimeter diameter vävnadsodlingsplatta för att uppnå 70 till 80% sammanflöde. Nästa dag, tillsätt två milliliter trypsinlösning till vävnadsodlingsplattan och inkubera i två till tre minuter tills cellerna lossnar.

Tillsätt fem milliliter av mediet för att inaktivera trypsinet. Använd en hemacytometer, räkna cellerna och plattan 20 000 celler i två milliliter av det kompletta mediet i en bottenskål. Inkubera sedan skålen med pläterade celler i en inkubator i 15 minuter.

Slå på värmeenheten och ställ in den på 37 grader Celsius en timme före avbildning. Slå också på koldioxidenheten och ställ in den på 5%10 minuter före avbildning. Slå på mikroskopet och kameran.

Slå på datorn och öppna programvaran för förvärv av mikroskop. Ställ in förstoringen på en 40X torr linsfaskontrast. Ställ in den totala filmlängden på 10 minuter med ett tidsintervall på fem sekunder.

Efter 15 minuters inkubation, placera glasbottenskålen med vidhäftade celler i en adapter och fixa den. Sätt i adaptern med skålen i slitsarna i mikroskopsteget. Ta av disklocket, placera koldioxidlocket och öppna koldioxidventilen.

Leta reda på en lämplig cell för avbildning. Starta filmförvärv efter att ha fokuserat på cellen. För att utföra bildanalysen, välj det raka verktyget i bildanalysprogramvaran och gör åtta linjer med 20 godtyckliga enheter vinkelrätt mot utsprången i ett radiellt arrangemang vid varje 45 grader, inklusive lamell och cellkant.

I huvudverktygsfältet går du till bild, väljer Staplar och klickar sedan på Reslice för att generera en kymografbild som beskriver rörelsen av enskilda punkter i cellmembranet. Med hjälp av kymografbilderna extraherar och räknar du manuellt antalet utsprång, indragningar och volanger i var och en av de åtta regionerna i cellen som markeras av rutnätslinjerna. Dessa siffror representerar frekvensen av utsprång, indragningar och volanger per 10 minuter.

Bestäm utskjutningspersistensen, avståndet och hastigheten genom kymografianalys. För att bestämma utskjutningsavståndet, rita vinkelrätt linje från utsprångets botten till utsprångets högsta topp. Tryck på M för att mäta längden på linjen i pixlar och se till att förhållandet mellan pixel och mikrometer är känt för att konvertera längden i mikrometer.

Kvantifiering av utsprång, reaktioner och volanger utfördes manuellt per 10 minuter och den genomsnittliga frekvensen som erhölls för utsprång och indragningar var 5,1 och 2,1 för volanger. Den representativa kymografen hade ett utskjutningsavstånd på cirka 4,8 mikrometer och en utskjutningstid på cirka 0,6 minuter. Ett exempel på en cell som ska uteslutas från analysen representeras.

Kymografianalysen visade att cellen inte var närvarande i sin spridningsfas och inte visade några tydliga membranutsprång. Det viktigaste är att välja rätt celler för avbildning. En riktig cell bör vara i sin spridningsfas och bör inte röra andra celler för att undvika cell-cellkommunikation och signalering.

Metoden kan användas som ett preliminärt verktyg för att testa cytoskelettdynamik som involverar cellmotilitet innan man bestämmer sig för att utföra fler resultat som kräver cellmigrationsanalyser.