Microdissection et dissociation de l’oviducte murin : identification de segment individuel et isolement unicellulaire

Différents segments d’oviductes ont des fonctions physiologiques distinctes et sont différentiellement sensibles aux changements pathologiques. L’identification des différents segments dans un très petit oviducte de souris est difficile, tout comme la production d’un bon rendement de cellules bien différenciées par dissociation tissulaire. Dans cette vidéo, nous montrerons comment dérouler l’oviducte de souris, reconnaître les différents segments afin qu’ils puissent être analysés individuellement, et enfin, comment produire un rendement relativement élevé de cellules dissociées différenciées.

Une meilleure compréhension de l’environnement propre à l’ampoule peut améliorer les techniques de fécondation in vitro. En outre, en comparant l’infundibulum avec d’autres segments, nous pouvons mieux comprendre la propension de l’infundibulum à la transformation maligne. La procédure de dissociation unicellulaire libère les cellules stromales et épithéliales de l’oviducte.

Notre méthode offre également la possibilité d’analyser séparément les contributions immunitaires, musculaires lisses et épithéliales à la physiologie et à la pathologie de l’oviducte. Travailler sous un microscope à dissection peut être difficile au début. Je conseillerais de pratiquer avec un tube plus grand comme l’utérus pour vous assurer que vos outils sont adéquats pour la microdissection de l’oviducte.

Commencez par apposer un morceau de cire dentaire sur une boîte de Petri avec de l’adhésif et laissez-le sécher. Ensuite, désinfectez le plat avec 70% d’éthanol. La surface est maintenant prête pour la dissection.

Immobilisez la boîte de Petri contenant la cire dentaire sur la plate-forme froide sous un microscope à dissection lorsqu’elle est prête pour la dissection. Désinfectez la surface ventrale de l’animal avec de l’éthanol à 70%. Ouvrez ensuite la cavité abdominale et pelvienne avec des ciseaux à dissection stériles.

Déplacez le tractus gastro-intestinal d’un côté pour localiser l’utérus bihornal dorsal. Suivez chaque corne utérine rostralement pour localiser chaque oviducte et ovaire qui sont enveloppés dans le coussinet adipeux utérin juste en dessous du rein. Ensuite, éliminez les deux oviductes latéraux avec les ovaires et une partie de la corne utérine distale encore attachée à l’aide de ciseaux à dissection.

Coupez chaque corne utérine latérale avec environ un à deux centimètres de la corne encore attachée à l’oviducte enroulé et à l’ovaire. Immergez immédiatement le tissu dans deux millilitres de milieu de dissection à froid, puis fixez le tissu utérin à la cire dentaire avec une aiguille stérile de calibre 25 pour sécuriser le tissu pour la dissection. Nettoyez et disséquez le coussinet adipeux ovarien et le tissu conjonctif pour visualiser clairement l’oviducte.

Utilisez une seringue d’un millilitre pour distribuer une à deux gouttes de solution stérile de colorant bleu de toluidine à 1% et incuber pendant 30 secondes à une minute. Rincer avec du DPBS froid, puis retirer tout le liquide. Tirez légèrement l’ovaire de l’oviducte enroulé.

Couper la membrane de la bourse dans le ligament large pour retirer l’ovaire de l’oviducte sans compromettre le tissu tubaire. Localisez l’extrémité fimbriale distale de l’oviducte située latéralement à la jonction tubaire utérine. Tirez doucement le tube et coupez le mésosalpinx avec des micro-ciseaux à ressort pour dérouler l’oviducte.

Coupez le tube pour produire la région infundibulaire. Ensuite, excisez la région ampullaire en coupant entre les tours deux et trois. Enfin, coupez la partie restante à la jonction tubaire utérine qui est la région isthmique.

Congelez immédiatement les segments de tissu disséqués dans de l’azote liquide, puis ajoutez 200 microlitres de réactif d’extraction d’ARN froid et un mélange de billes d’homogénéisation un à un au tissu pour l’isolement de l’ARN. À partir de la région fimbriale, fendez le tube longitudinalement avec des ciseaux à ressort et utilisez une pince comme levier pour exposer l’épithélium luminal. Hacher les parties ouvertes fendues et l’oviducte restant en segments d’environ un à deux millimètres.

Ajoutez ensuite cinq millilitres de tampon de dissociation chaud non enzymatique au tissu et incubez à 37 degrés Celsius. Des images fluorescentes et à contraste de phase d’un groupe cellulaire positif pour l’occludine, les noyaux et la tubuline acétylée sont montrées ici. Le rouge indique l’occludine, le bleu les noyaux et le vert la tubuline acétylée.

La bordure apicale ciliée reste intacte tout au long du protocole et résiste à une digestion ultérieure vers des cellules individuelles. Dans ces images représentatives, les couches fusionnées, rouges, bleues, à contraste de phase et vertes sont affichées. Après une brève incubation de la pronase, la majorité des cellules sont uniques.

La coloration à l’iodure de propidium montre une viabilité d’environ 93% en fond clair, en canal rouge PI positif et en fusion. L’encart lors de la fusion montre une bordure ciliée intacte sur une seule cellule dissociée. Ces cellules ont des cils battant activement.

Le rendement et la qualité de l’ARN entier ont été évalués par spectrophotomètre à microvolume et bioanalyseur. Les résultats montrent que cette méthode donne 800 à 1 200 nanogrammes d’ARN par segment, sauf pour les échantillons infundibulaires où la mise en commun de deux animaux peut être nécessaire pour un rendement approprié pour les essais en aval. Les résultats présentés pour infundibulum sont regroupés à partir de deux animaux, totalisant quatre régions infundibulaires.

Ce protocole permet d’obtenir avec succès de l’ARN pur analysé à l’aide d’un spectrophotomètre à microvolume et d’un bioanalyseur. Les échantillons ont un rapport d’absorption de 260 par 280 nanomètres entre 1,8 et 2, typique des espèces de nucléotides d’ARN purs. La bioanalyse des échantillons a montré une intégrité élevée de l’ARN avec un nombre d’ARN évalué supérieur à sept, approprié pour l’analyse de l’expression et du séquençage en aval.

N’oubliez pas de retenir un à deux centimètres de la corne utérine pour fixer le système tubaire à la plate-forme de dissection. De plus, l’utilisation du colorant bleu toluidine aide au débobinage rapide de l’oviducte. Plus le débobinage est rapide, meilleure est la conservation et la plus petite quantité de dégradation de l’ARN.

Cette méthode est suffisante pour obtenir un ARN de qualité appropriée pour le séquençage de l’ARN permettant le séquençage de segments individuels. La dissociation cellulaire est appropriée pour le séquençage unicellulaire ou la cytométrie en flux permettant une analyse plus précise des segments et des cellules. La méthode aidera à déplacer le champ au-delà de l’analyse de tube entier qui masque les différences au niveau du segment ou de la cellule unique.