Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Het voorbereiden en fokken van axeeninsecten met weefsel gekweekte zaailingen voor gastheer-darmmicrobiota-interactiestudies van de bladkever
Chapters
Summary
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Om een axeeninsect te verkrijgen, wordt het eioppervlak gesteriliseerd en wordt de uitgekomen larve vervolgens grootgebracht met behulp van axeenbladeren. Deze methode biedt een efficiënte manier voor axeeninsectenbereiding zonder antibiotica toe te dienen of een kunstmatig dieet te ontwikkelen, dat ook kan worden toegepast op andere bladetende insecten.
Transcript
De darmbacteriën kunnen meerdere fysiologische processen van insectengastheren beïnvloeden. Het voorbereiden en onderhouden van axeenlarven is een krachtig hulpmiddel om darmbacteriënfuncties te bestuderen. De belangrijkste voordelen van dit protocol zijn dat plantenweefselkweek wordt gebruikt om kiemvrije bladeren te verkrijgen om axeenbladetende insecten te achterhalen die zijn afgeleid van oppervlaktegesteriliseerde eieren, en dat deze methode niet wordt beperkt door kunstmatige diëten.
Deze methode is handig en verhoogt de zichtbaarheid van het behoud van axeeninsecten voor toekomstige darmbacteriënstudies, vooral voor niet-modelinsecten zonder goed ontwikkelde kunstmatige diëten. Houd de P.versicolora-populatie in een groeikamer op 27 graden Celsius en 70% relatieve vochtigheid, met een licht van 16 uur en een donkere fotoperiode van acht uur. Plaats de insecten in geperforeerde plastic dozen met gekanteld nat absorberend papier en voer ze verse populierentakken.
Spuit schoon water op absorberend papier om vocht vast te houden en ververs de takken om de twee dagen. Isoleer volwassenen voor ovipositie na verpopping en voer ze zachte bladeren om meer eieren te verkrijgen. Verzamel binnen 24 uur nieuw gelegde eieren en plaats ze gedurende 60 uur op vochtig absorberend papier om axeenlarven te bereiden.
Bereid MS-medium in één milligram per milliliter alfa-naftaleenazijnzuur of NAA-stamoplossingen. Voeg in een bioveiligheidskap 50 microliter van de NAA-voorraadoplossing toe aan 500 milliliter MS-medium en schud om goed te mengen. Giet vervolgens ongeveer 50 milliliter per weefselkweekcontainer en wacht op stolling.
Steriliseer scalpels en tangen in een alcohollampvlam in de bioveiligheidskap. Snijd drie tot vier centimeter stengelsegmenten met apicale knoppen of laterale knoppen van populierenzaailingen bij ongeveer een maand groei en breng ze in het kweekmedium, een of twee stengelsegmenten per container. Incubeer deze stengelsegmenten ongeveer 30 dagen in een groeikamer.
En gebruik deze kiemvrije bladeren om de axeenlarven te voeden. Autoclaaf Petrischaaltjes, verfkwasten, filtreerpapier, gedestilleerd water in een petrischaaltje met LB-agarmedium. Leg bladeren met aanhangende eieren in een petrischaaltje.
Verwijder vervolgens voorzichtig de eieren van de bladeren met een tang en breng ze over naar een andere petrischaal. Was deze eieren acht minuten met 75% ethanol. Herhaal vervolgens de was vier keer met steriel water.
Breng de eieren over op LB-agarmedium om vocht te behouden voor het uitkomen. Plaats de petrischaal in een groeikamer en wacht tot de eieren binnen 24 uur uitkomen. Tegel in een bioveiligheidskap drie stukken nat filterpapier in een petrischaaltje en plaats kiemvrije populierenbladeren op het papier.
Verzamel de larven en plaats ze op de bladeren. Sluit de petrischaal af met Parafilm en incubeer deze in een groeikamer. Vervang de bladeren om de twee dagen.
Breng voor de conventioneel gekweekte groepen de eieren van de bladeren over naar een petrischaal met vochtig filterpapier en voed deze larve met kiemvrije populierenbladeren. Selecteer willekeurig drie eerste, tweede en derde instarlarven uit de kiemvrije en conventioneel gekweekte groepen. Ontleed de derde instarlarven met een steriele schaar en tang onder een stereomicroscoop en verzamel hun ingewanden in microcentrifugebuizen.
Verzamel intacte eerste en tweede instar larven in buizen. Voeg 100 microliter PBS en drie stalen kogels toe aan de buizen van 1,5 milliliter en maal de weefsels tot homogenaten met behulp van een kralenklophomogenisator. Voeg 100 microliter homogenaat toe aan LB-agarmedium en -plaat met behulp van een steriele glazen spreidstaaf.
Incubeer de platen bij 37 graden Celsius gedurende 24 uur. Observeer vervolgens de bacteriekolonies. Extraheer het totale DNA van de eerder verkregen weefsels met behulp van een DNA-extractiekit en meet de DNA-concentratie met een spectrofotometer.
Amplify het bacteriële 16S rRNA-gen met behulp van universele 16S rRNA-primers met PCR, waardoor de reactie wordt opgezet zoals beschreven in het teksthandschrift. Bewaar de PCR-producten bij vier graden Celsius tot verdere analyse. Meng de PCR-producten met nucleïnezuurkleurstof en analyseer ze met behulp van elektroforese op een 1% agarose-gel in 1X TAE-buffer.
Gebruik 10 microliter van een DNA-marker als referentie. Observeer de gel met een UV-transilluminator en zoek naar het doelfragment rond 1.500 basenparen. Hoewel er geen bacteriekolonies werden waargenomen in een kiemvrije groep, werden ze waargenomen in alle conventioneel gekweekte groepen, wat aangeeft dat larven uit gesteriliseerde eieren die weefsel gekweekte populierenbladeren kregen, geen bacteriën bevatten.
De 1.500 basenpaar PCR-banden verschenen in alle conventioneel gekweekte groepen. Daarentegen werd geen band waargenomen in de kiemvrije groepen of de negatieve controle, wat impliceert dat er geen darmbacteriën bestonden in axeenlarven. Voor insectensoorten met kleine eieren moesten de soorten ontsmettingsmiddelen en sterilisatieduur worden geoptimaliseerd.
Bovendien moeten endofyten in weefsel gekweekte planten opmerkelijk zijn. Dit protocol biedt een nieuwe methode om kiemvrije insecten te behouden, wat een handig hulpmiddel is om interactiestudies tussen insecten en darmbacteriën te vergemakkelijken, vooral voor niet-modelinsecten zonder goed ontwikkelde kunstmatige diëten.
Tags
Biologie Nummer 176Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
