Biology
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पत्ती बीटल के मेजबान-आंत माइक्रोबायोटा इंटरैक्शन स्टडीज के लिए ऊतक सुसंस्कृत रोपाई के साथ एक्सनिक कीड़े तैयार करना और पालन करना
Chapters
Summary October 8th, 2021
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एक एक्सेनिक कीट प्राप्त करने के लिए, इसकी अंडे की सतह को निष्फल किया जाता है, और हैच किए गए लार्वा को बाद में एक्सेनिक पत्तियों का उपयोग करके पाला जाता है। यह विधि एंटीबायोटिक दवाओं को प्रशासित किए बिना या कृत्रिम आहार विकसित किए बिना एक्सेनिक कीट तैयारी के लिए एक कुशल तरीका प्रदान करती है, जिसे अन्य पत्ती खाने वाले कीड़ों पर भी लागू किया जा सकता है।
Transcript
आंत बैक्टीरिया कीट मेजबानों की कई शारीरिक प्रक्रियाओं को प्रभावित कर सकता है। एक्सेनिक लार्वा तैयार करना और बनाए रखना आंत बैक्टीरिया के कार्यों का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। इस प्रोटोकॉल के मुख्य लाभ यह हैं कि पौधे के ऊतक संस्कृति का उपयोग रोगाणु मुक्त पत्तियों को प्राप्त करने के लिए किया जाता है ताकि एक्सेनिक पत्ती खाने वाले कीड़े सतह-निष्फल अंडे से व्युत्पन्न हो सकें, और यह विधि कृत्रिम आहार द्वारा प्रतिबंधित नहीं है।
यह विधि सुविधाजनक है और भविष्य के आंत बैक्टीरिया के अध्ययन के लिए एक्सेनिक कीड़ों को बनाए रखने की दृश्यता में वृद्धि करती है, विशेष रूप से अच्छी तरह से विकसित कृत्रिम आहार के बिना गैर-मॉडल कीड़ों के लिए। 16 घंटे की रोशनी और आठ घंटे के अंधेरे फोटोपरियोड के साथ, 27 डिग्री सेल्सियस और 70% सापेक्ष आर्द्रता पर एक विकास कक्ष में पी.वर्सिकोलोरा आबादी को बनाए रखें। झुके हुए गीले अवशोषित कागज के साथ छिद्रित प्लास्टिक के बक्से में कीड़ों को रखें, और उन्हें ताजा चिनार शाखाओं को खिलाएं।
नमी बनाए रखने के लिए पेपर को अवशोषित करने पर साफ पानी स्प्रे करें, और हर दो दिनों में शाखाओं को बदलें। प्यूपेशन के बाद ओविपोज़िशन के लिए वयस्कों को अलग करें, और अधिक अंडे प्राप्त करने के लिए उन्हें निविदा पत्तियों को खिलाएं। 24 घंटों के भीतर, नए रखे गए अंडे इकट्ठा करें और उन्हें एक्सनिक लार्वा तैयार करने के लिए 60 घंटे के लिए नम अवशोषित कागज पर रखें।
एमएस माध्यम को एक मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर अल्फा-नेप्थलीन एसिटिक एसिड या एनएए स्टॉक समाधान में तैयार करें। एक जैव सुरक्षा हुड में, एमएस माध्यम के 500 मिलीलीटर में एनएए स्टॉक समाधान के 50 माइक्रोलीटर जोड़ें, और अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए हिलाएं। फिर ऊतक संस्कृति कंटेनर प्रति लगभग 50 मिलीलीटर डालें और ठोसकरण की प्रतीक्षा करें।
बायोसेफ्टी हुड में अल्कोहल लैंप लौ में स्केलपेल और संदंश को निष्फल करें। वृद्धि के लगभग एक महीने में चिनार के अंकुरों से एपिकल कलियों या पार्श्व कलियों के साथ तीन से चार सेंटीमीटर स्टेम सेगमेंट काटें, और उन्हें संस्कृति माध्यम, प्रति कंटेनर एक या दो स्टेम सेगमेंट में डालें। लगभग 30 दिनों के लिए एक विकास कक्ष में इन स्टेम खंडों सेते हैं।
और एक्सेनिक लार्वा को खिलाने के लिए इन रोगाणु मुक्त पत्तियों का उपयोग करें। आटोक्लेव पेट्री डिश, पेंट ब्रश, फिल्टर पेपर, एलबी अगर माध्यम युक्त पेट्री डिश में आसुत पानी। पेट्री डिश में पक्षपाती अंडे के साथ पत्तियों को रखें।
फिर ध्यान से संदंश का उपयोग कर पत्तियों से अंडे निकालें और उन्हें एक और पेट्री डिश में स्थानांतरित करें। इन अंडों को आठ मिनट के लिए 75% इथेनॉल के साथ धो लें। फिर बाँझ पानी के साथ धोने को चार बार दोहराएं।
अंडे को एलबी अगर माध्यम पर स्थानांतरित करें ताकि हैचिंग के लिए नमी को संरक्षित किया जा सके। पेट्री डिश को एक विकास कक्ष में रखें और 24 घंटों के भीतर अंडे सेने की प्रतीक्षा करें। एक जैव सुरक्षा हुड में, पेट्री डिश में गीले फिल्टर पेपर के तीन टुकड़ों को टाइल करें, और कागज पर रोगाणु मुक्त चिनार के पत्ते रखें।
लार्वा को इकट्ठा करें और उन्हें पत्तियों पर रखें। पैराफिल्म के साथ पेट्री डिश को सील करें, और इसे विकास कक्ष में सेते हैं। हर दो दिन में पत्तियों को बदलें।
पारंपरिक रूप से पाले गए समूहों के लिए, पत्तियों से अंडे को नम फिल्टर पेपर युक्त पेट्री डिश में स्थानांतरित करें, और इन लार्वा को रोगाणु मुक्त चिनार पत्तियों के साथ खिलाएं। बेतरतीब ढंग से रोगाणु मुक्त और पारंपरिक रूप से पाले गए समूहों से तीन पहले, दूसरे और तीसरे इंस्टार लार्वा का चयन करें। एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत बाँझ कैंची और संदंश के साथ तीसरे इंस्टार लार्वा विच्छेदन, और microcentrifuge ट्यूबों में उनकी हिम्मत इकट्ठा।
ट्यूबों में बरकरार पहले और दूसरे इंस्टार लार्वा ले लीजिए। 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों में पीबीएस के 100 माइक्रोलीटर और तीन स्टील गेंदों को जोड़ें, और ऊतकों को एक मनका पिटाई होमोजेनाइज़र का उपयोग करके होमोजेनेट्स में पीस लें। एक बाँझ ग्लास फैलाने वाली रॉड का उपयोग करके एलबी अगर माध्यम और प्लेट में होमोजेनेट के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें।
प्लेटों को 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। फिर बैक्टीरियल कालोनियों का निरीक्षण करें। डीएनए निष्कर्षण किट का उपयोग करके पहले से प्राप्त ऊतकों के कुल डीएनए को निकालें, और एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ डीएनए एकाग्रता को मापें।
पीसीआर के साथ सार्वभौमिक 16 एस आरआरएनए प्राइमरों का उपयोग करके बैक्टीरियल 16 एस आरआरएनए जीन को बढ़ाएं, पाठ पांडुलिपि में वर्णित प्रतिक्रिया की स्थापना करें। आगे के विश्लेषण तक पीसीआर उत्पादों को चार डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। न्यूक्लिक एसिड डाई के साथ पीसीआर उत्पादों को मिलाएं और 1 एक्स टीएई बफर में 1% एगारोज जेल पर वैद्युतकणसंचलन का उपयोग करके उनका विश्लेषण करें।
एक संदर्भ के रूप में एक डीएनए मार्कर के 10 माइक्रोलीटर का उपयोग करें। यूवी ट्रांसल्यूमिनेटर के साथ जेल का निरीक्षण करें, और 1, 500 आधार जोड़े के आसपास लक्ष्य टुकड़े की तलाश करें। यद्यपि किसी भी रोगाणु मुक्त समूह में कोई जीवाणु कालोनियों को नहीं देखा गया था, लेकिन उन्हें सभी पारंपरिक रूप से पाले गए समूहों में देखा गया था, यह दर्शाता है कि निष्फल अंडे से लार्वा जो ऊतक सुसंस्कृत चिनार पत्तियों को खिलाया गया था, उनमें कोई बैक्टीरिया नहीं था।
1, 500 बेस जोड़ी पीसीआर बैंड सभी पारंपरिक रूप से पाले गए समूहों में दिखाई दिए। इसके विपरीत, रोगाणु मुक्त समूहों या नकारात्मक नियंत्रण में कोई बैंड नहीं देखा गया था, जिसका अर्थ है कि एक्सेनिक लार्वा में कोई आंत बैक्टीरिया मौजूद नहीं था। छोटे अंडों के साथ कीट प्रजातियों के लिए, कीटाणुनाशक और नसबंदी अवधि के प्रकार को अनुकूलित करने की आवश्यकता थी।
इसके अलावा, ऊतक-सुसंस्कृत पौधों में एंडोफाइट्स उल्लेखनीय होना चाहिए। यह प्रोटोकॉल रोगाणु मुक्त कीड़ों को बनाए रखने के लिए एक नई विधि प्रदान करता है, जो कीट-आंत बैक्टीरिया इंटरैक्शन अध्ययन ों को सुविधाजनक बनाने के लिए एक आसान उपकरण है, विशेष रूप से अच्छी तरह से विकसित कृत्रिम आहार के बिना गैर-मॉडल कीड़ों के लिए।
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