Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
量子点偶联SARS-CoV-2穗状三聚体的高通量共聚焦成像，以追踪HEK293T细胞中的结合和内吞作用
Chapters
Summary
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
在该协议中，与重组SARS-CoV-2尖峰偶联的量子点使基于细胞的测定能够监测质膜上与hACE2的尖峰结合以及随后结合蛋白进入细胞质的内吞作用。
Transcript
我们已经建立了针对SARS COVID 2的平台技术，该技术可以应用于其他病毒，Spike介导的细胞识别和进入是细胞病毒感染的第一步。量子点明亮、稳定，其表面可以针对各种蜂窝应用进行功能化。使用这种方法，我们可以可视化和测量Spike内化到细胞中。
准备0.1%BSA。将130微升7.5%BSA加入10毫升混合的成像培养基中。对于6.1至3个连续稀释和一式三份，加入14.26微升QD Spike至285.74微升0.1%BSA，以达到最高浓度的20纳摩尔。
然后向20.1%BSA的200微升或QD Spike中加入100微升的20.1%BSA，以产生6.67纳摩尔QD Spike的第二种错觉。用多通道吸气器从每个孔中取出所有用过的培养基，用多通道移液器洗涤一次，每孔100微升成像培养基，然后吸出100微升成像培养基。每孔回添加50微升QD Spike溶液，并将板在37摄氏度的加湿培养箱中孵育3小时，其中二氧化碳含量为5%。
穿戴防护设备，在无菌生物安全柜内制备4%PFA和0.1%PSA成像培养基，从每个孔中抽出50微升QD Spike，并使用自动多通道移液器每孔添加100微升4%PFA，以避免孔干燥。在室温下孵育15分钟，然后用PBS洗涤三次，通过将5毫米的储备溶液稀释在PBS中1至1000来制备深红色核染料，吸出PBS并每孔回添加50微升稀释的核染料。在室温下孵育30分钟，然后用PBS洗涤三次，对板进行成像或使用板封口器密封，以便以后成像。
将盘子存放在四摄氏度。启动映像平台的软件。在成像平台中记录后，通过选择板类型作为96壁透明底部成像板，选择光学模式已聚焦并放大为40倍水浸，选择分档作为一个。
选择数字人脸对比度（如高对比度）的模式，以生成定义明确的细胞体。拍摄快照以确认此标题是否合适，如图像窗口中所示，选择适合的C通道与ACE2-GFP细胞系一起使用，以可视化细胞内的ACE2转运。要制作自定义QD通道，请选择三角形下拉菜单，然后选择405纳米范围内的激发，发射范围为608纳米，选择具有鲁棒细胞质QD信号的孔以设置曝光时间，激光功率和Z高度位置。
检查默认高度是否生成所需焦平面中单元格的图像。内吞细胞点的Z位置将低于质膜的Z位置。选择曝光时间，通常在100到300毫秒之间，以产生灰度水平至少三倍的明亮图像。
在20纳摩尔时，灰度水平应约为6， 000个原子单位，暴露时间为200毫秒，激光功率为80%。通过右键单击每个通道中使用快照功能生成的图像并选择显示强度来检查灰度级别，然后左键单击感兴趣的对象或背景以查看该像素的灰度级别，调整激光功率以微调感兴趣对象的强度。保存采集协议，切换到运行实验并输入板名称，运行实验。
使用荧光显微镜和表达ACE2-GFP的细胞系可视化QD和ACE2的易位。执行图像分割和后续分析以提取相关参数，例如点计数。首先，将原子核从核标记通道中分离出来，以产生ROI群体。
然后是一个ROI区域，使用ACE2-GFP通道勾勒出分段的像元。最后，QD 608尖峰点从小区ROI区域进行分段，内化QD和ACE2信号表现出较强的共定位。在HEK 293T细胞中进行了六种不同浓度的QD Spike的浓度反应实验。
确定量子点的光学浓度，量子点可以使用低至2.22纳摩尔，但是，建议使用10纳摩尔或更高的浓度，以确保强大的响应。在与QD蛋白偶联期间可能发生聚集。在QD溶液中发现聚集物作为明亮的聚集沉淀物和HEK 293T细胞，QD与中和抗体一起孵育，从每微升30微升开始，然后加入细胞，这些抗体阻断结合内化并导致斑点计数减少与仅用QD处理的细胞相比。
本文还可用于高通量筛选，中和抗体的先导评估，以识别阻断病毒进入的双关抗病毒药物，并适用于研究新出现的变异。
Tags
生物学，第182期，Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
