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April 21, 2022
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私たちは、スパイク媒介細胞の認識と侵入を細胞ウイルス感染の第一歩として、他のウイルスにも適用できるSARS新型コロナウイルスCOVID 2のプラットフォーム技術を確立しました。量子ドットは明るく、安定しており、その表面は様々な細胞用途のために官能化することができる。この方法を使用すると、細胞へのスパイクのインターナリゼーションを視覚化して測定することができます。
0.1%BSAを準備する。10ミリリットルのイメージングメディアに130マイクロリットルの7.5%BSAを加えます。6.1~3段階希釈および3連の場合は、14.26マイクロリットルのQDスパイクを285.74マイクロリットルの0.1%BSAに加え、最高濃度の20ナノモルにします。
次に、100マイクロリットルの20ナノモルまたはQDスパイクを200マイクロリットルの0.1%BSAに追加して、6.67ナノモルのQDスパイクの2番目の妄想を行います。マルチチャンネルアスピレーターで各ウェルからすべての使用済み培地を取り出し、ウェルあたり100マイクロリットルのイメージングメディアを含むマルチチャンネルピペットで1回洗浄し、次に100マイクロリットルのイメージングメディアを吸引します。1ウェルあたり50マイクロリットルのQDスパイク溶液を再び添加し、プレートを摂氏37度の加湿インキュベーターで5%の二酸化炭素で3時間インキュベートする。
保護具を着用し、滅菌バイオ安全キャビネット内に4%PFAおよび0.1%PSAイメージングメディアを準備し、各ウェルから50マイクロリットルのQDスパイクを吸引し、ウェルの乾燥を避けるために自動マルチチャンネルピペットでウェルあたり100マイクロリットルの4%PFAを追加します。室温で15分間インキュベートし、次いでPBSで3回洗浄し、5ミリメートルの原液をPBSで1〜1000で希釈して深赤色核色素を調製し、PBSを吸引し、1ウェルあたり50マイクロリットルの希釈核色素を戻す。室温で30分間インキュベートし、PBSで3回洗浄し、プレートを画像化するか、後でイメージング用のプレートシーラーを使用してシールします。
プレートを摂氏 4 度で保管します。イメージングプラットフォーム用のソフトウェアを起動します。イメージングプラットフォームにログインした後、96ウォール透明底イメージングプレートとしてプレートタイプを選択して新しい取得プロトコルを作成し、焦点と倍率を40倍の水浸漬として行った光学モードを選択し、ビニングを1つとして選択します。
ハイコントラストなどのデジタル顔コントラストのモードを選択して、明確に定義された細胞体を生成します。スナップショットを撮って、画像ウィンドウに表示されるこの見出しが適切であることを確認し、ACE2-GFP細胞株で使用する適合Cチャネルを選択して、細胞内のACE2トラフィッキングを視覚化します。カスタムQDチャンネルを作成するには、三角形のドロップダウンメニューを選択し、608ナノメートルの範囲の発光で405ナノメートルの範囲の励起を選択し、堅牢な細胞質QD信号を持つ井戸を選択して、露光時間、レーザーパワー、Z高さ位置を設定します。
デフォルトの高さで、目的の焦点面内のセルのイメージが生成されるかどうかを確認します。Z位置は、原形質膜に対するZ位置よりもエンドサイトース穿刺の方が低くなるであろう。通常、100 ~ 300 ミリ秒の露光時間を選択して、背景信号の少なくとも 3 倍のグレーレベルの明るい画像を生成します。
20ナノモルでは、グレーレベルは約6,000原子単位で、露光時間は200ミリ秒で、レーザー出力は80%です。各チャンネルのスナップショット機能で生成された画像を右クリックして[強度を表示]を選択し、目的のオブジェクトまたは背景を左クリックしてそのピクセルのグレーレベルを表示し、レーザー出力を調整して目的のオブジェクトの強度を微調整します。取得プロトコルを保存し、実験の実行に切り替えてプレート名を入力し、実験を実行します。
QDおよびACE2の両方の転座を、蛍光顕微鏡法およびACE2−GFP発現細胞株を用いて可視化した。画像セグメンテーションとその後の分析を行い、スポットカウントなどの関連パラメータを抽出しました。まず、核マーカーチャネルから核をセグメント化してROI集団を作成した。
次に、ACE2−GFPチャネルを用いてセグメント化して細胞を輪郭を描くROI領域を作製する。最後に、QD 608スパイクスポットは、細胞ROI領域からセグメント化され、インターナライズされたQDおよびACE2シグナルは、強い共局在を示した。6つの異なる濃度のQDスパイクを用いた濃度応答実験を、HEK 293T細胞において実施した。
QDの光学濃度を決定する場合、QDSは2.22ナノモルまで低く使用できますが、堅牢な応答を確保するために10ナノモル以上の濃度を使用することをお勧めします。QDタンパク質へのコンジュゲーション中に凝集が起こり得る。凝集体を、明るい凝集沈殿物およびHEK 293T細胞としてQD溶液中にスポットし、QDsを細胞に添加する前にマイクロリットル当たり30マイクログラムで開始する中和抗体と共にインキュベートし、これらの抗体が結合インターナリゼーションをブロックし、QDのみで処理した細胞と比較してスポット数の減少を引き起こした。
このエッセイは、ハイスループットスクリーニング、中和抗体の評価をリードして、ブロックウイルスの侵入に対する抗ウイルス薬を同定し、新たに出現するバリアントの研究に適応させることもできます。
Summary
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このプロトコルでは、組換えSARS-CoV-2スパイクにコンジュゲートした量子ドットは、細胞ベースのアッセイを可能にし、原形質膜でのhACE2へのスパイク結合およびその後の細胞質への結合タンパク質のエンドサイトーシスをモニターする。
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Tran, B. N., Oh, E., Susumu, K., Wolak, M., Gorshkov, K. High-throughput Confocal Imaging of Quantum Dot-Conjugated SARS-CoV-2 Spike Trimers to Track Binding and Endocytosis in HEK293T Cells. J. Vis. Exp. (182), e63202, doi:10.3791/63202 (2022).
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