Aktuell applikationsbioassay för att kvantifiera insekticidtoxicitet för myggor och fruktflugor

Genom att direkt applicera insektsmedel på insekten snarare än genom ytkontakt finns det minimal variation i exponering för insektsmedel, och detta gör att vi kan mäta känslighetsprofilen för myggpopulationer mer exakt. Den största fördelen med denna teknik är att den tillåter oss att beräkna massrelativiserade dödliga doser av ett insektsmedel snarare än dödliga koncentrationer, vilket avsevärt förbättrar jämförelser av resistensförhållanden. Var noga med att förvara insekticiderna ordentligt, undvik att förorena dina verktyg och se till att sprutdelarna är i gott skick.

Detta hjälper dig att få konsekventa resultat. För att börja, ta bort de nödvändiga insekticidlösningarna från frysen. Omedelbart virvla lösningen eller invertera fem gånger och placera den i en ljusbeständig behållare vid rumstemperatur för att låta insekticiderna värmas till rumstemperatur före användning.

Ställ ut fem mikrocentrifugrör med 0,5 ml aceton vardera. Fyll sprutfatet helt med aceton från det första röret. Utvisa sedan acetonen i en avfallsbehållare genom att snabbt trycka ner kolven och upprepa ytterligare fyra gånger för att slutföra totalt fem acetontvättar från samma acetonalitquot.

Fyll sedan sprutfatet helt med luft och utvisa luften och potentiella acetonrester i avfallsbehållaren. Upprepa ytterligare två gånger för att slutföra tre tvättar med luft. Skapa en luftficka i pipan mellan sprutkolven och toppen av nålen genom att dra upp kolven cirka fem millimeter i pipan.

Märk plasthållkopparna med slumpmässigt ID för blind dödlighetsbedömning. Använd en aspirator som drivs av sug från inandning, aspirera det önskade antalet tre till fem dagar gamla vuxna myggor. Placera andningsspetsen i röret med bomull lindad runt spetsen.

Andas försiktigt ut och knacka på aspiratorn för att överföra myggorna till ett koniskt rör. Använd bomullen för att plugga röret när andningsspetsen tas bort och täck sedan med locket. Slå kort ner myggorna i rören genom att placera dem i minst 10 minuter vid fyra grader Celsius eller begrava dem under isen i en isbricka.

Överför de nedslagna myggorna till insektshanteringstältet. Tippa försiktigt myggorna ut på en plastbricka placerad på isen och häll cirka 50 myggor åt gången för att säkerställa att var och en rör vid den svala brickan under den och förblir nedslagen. Sortera myggorna efter kön genom att försiktigt plocka upp dem vid benen eller vingarna med pincett, följt av att placera varje kön i en separat hållkopp och sluta när önskat antal uppnås.

Ta bort eventuella myggor som är skadade eller är extra stora eller små när du sorterar. För att registrera myggkoppens vikt, placera en tom kopp med en petriskål som lock på vågen och tara vågen. Häll myggorna i behållaren och lägg locket ovanpå.

Placera behållaren på vågen och registrera den slutliga vikten tillsammans med antalet myggor. Placera omedelbart koppen med exemplar tillbaka på isen för att hålla dem immobiliserade tills alla koppar av provet vägs. Dela de beredda myggorna i fem till 10 separata koppar placerade på is, märkta med slumpmässiga ID.

Använd pincett och en handhållen disk för att uppnå 20 till 25 myggor per kopp. För att sortera fruktflugorna, bedöva flugorna med koldioxid i sju sekunder. Häll flugorna på ett ispaket inslaget i bänkpapper.

Använd en finspetsad pensel, separera och räkna män och kvinnor. Använd penseln för att försiktigt plocka upp de valda flugorna och placera dem i en ren, tom lagerflaska. Efter att ha valt lika många manliga och kvinnliga fruktflugor, märk buljongflaskorna med stamnamnet och fruktflugan totalt.

Bedöva flaskan med fruktflugor med koldioxid i sju sekunder. Häll fruktflugorna på vägpapper och använd papperet som en tratt för att införa flugorna i en tjärad flaska märkt med ett slumpmässigt ID.Efter att ha placerat petriskållocket ovanpå flaskan med fruktflugor, placera den på vågen. Registrera den sammanlagda vikten och antalet exemplar på poängbladet.

Placera omedelbart flaskan med fruktflugor i en bricka med is med locket fortfarande ovanpå för att förhindra att flugorna flyr. Ladda sprutan med rätt insekticidkoncentration, börja med den minst koncentrerade dosen och arbeta mot den mest koncentrerade dosen med varje grupp av organismer. Tippa proverna på vägpapper som placeras ovanpå en bricka på isen.

Separera proverna som ligger nära varandra med en ren insekticidfri pensel eller bomullspinne för att ge enkel åtkomst till varje prov för dosering. Använd sprutan och applicera en droppe insekticidlösning på den ventrala bröstkorgen och bukområdet för myggor och dorsum för fruktflugor. Häll omedelbart proverna tillbaka i den märkta plastkoppen.

Täck koppen med nät och ett gummiband. Observera ett uppdaterat provantal på koppen om några exemplar dödades, skadades eller flydde i denna process. Lägg den färdiga koppen i en hållbricka.

För den första koppen, registrera tiden då dosningen är klar. Upprepa dosningen för varje kopp tills alla prover har doserats med rätt insekticidkoncentrationer och registrera sluttiden när alla prover har doserats. Ge 10% sackaroslösning till varje kopp via en våt bomullstuss och förvara myggorna och fruktflugorna vid önskad temperatur och fuktighet.

Registrera provdödlighet vid 24 timmar efter starten av exponering för insektsmedel. Klassificera myggor som levande om de kan flyga och hålla sig upprätt och döda om de är orörliga eller ataxiska, som beskrivs av WHO. Följ samma dödlighetsbedömning för bananflugor.

Efter att ha utfört bioassay erhölls dosresponsdata med två stammar som är Rockefeller- och IICC-genotyp för manliga och kvinnliga Aedes aegypti. Den massrelativismiserade mediandödliga dosen för Rockefeller och IICC var 0,008 respektive 0,336 nanogram per milligram. Resultaten avslöjade inga skillnader mellan dosresponskurvorna för kvinnliga och manliga myggor inom varje stam.

Därför kombinerades data från båda könen för att beräkna de genomsnittliga dödliga dosvärdena. Eftersom de 95 % konfidensintervallen för den genomsnittliga dödliga dosen av dessa två stammar inte överlappade varandra, ansågs dessa värden vara signifikant olika. Vid beräkning av de resistenta förhållandena var IICC-stammen dessutom över 40 gånger mer motståndskraftig än den mottagliga Rockefeller-stammen.

Dosresponsdata för bananfluga, Drosophila melanogaster, Canton-S-stammen, erhölls också, och den massrelativismiserade mediandödliga dosen befanns vara 0,213 nanogram per milligram. Konsistens är avgörande, särskilt vid lagring och applicering av insektsmedlet och bedömning av dödligheten. Var också försiktig när du hanterar provet för att undvika skada eller död som inte induceras av insektsmedlet.

Med denna metod kan vi nu exakt bestämma den tekniska resistensen hos en myggpopulation och hur miljöförhållandena påverkar motståndet eller hur tekniskt motstånd förutsäger praktiskt motstånd.