Effektiv SARS-CoV-2 Kvantitativ omvänd transkriptas PCR Saliva Diagnostisk strategi med hjälp av öppen källkod pipettering robotar

Vi har utvecklat ett billigt, salivbaserat COVID 19-diagnostiktest och arbetsflöde som är enkelt att implementera och skala upp för storskaliga community screening-applikationer. Här använder vi vätskehanteringsrobotar med öppen källkod, standard termocyklar och programvara för att utföra direkt testning av saliv utan extraktions- eller stabiliseringsbuffertar samtidigt som vi ger exakta diagnostiska resultat. På grund av de enkla automatiserade parallella arbetsflödena kan systemet skalas upp för att utföra tusentals tester dagligen med minimal utrustning, utrymme och personalbehov.

Förutom Kylie King kommer Rachel Ham, vår kliniska labbhandledare och Austin Smothers vår utbildningskoordinator, att hjälpa till att demonstrera proceduren Börja genom att dekontaminera utsidan av salivuppsamlingsrören med 70% etanol och överföra dem till laboratoriet för testning. Registrera exempel ankomsten genom att skanna varje exempel streckkod i kalkylbladet för dagligt intag. Värme behandla skanningsproverna i 30 minuter i en 95 grader Celsius ugn och ta sedan bort proverna med värmebeständiga handskar.

Öppna de dagliga exempelinläsningskalkylbladen för varje provladdningsrobot på exempeltilldelningsstationen. Tilldela sedan 188 prover till varje 384 brunnsplatta. Etikettbrickor med plåtnamn, datum och kvartalsnummer.

Skanna proverna i ordning i exempelinläsningskalkylbladet. På provladdningsstationen ställer du upp två hela uppsättningar av åtta 3D-utskrivna rack, vilket motsvarar däckplaceringen i roboten. Lossa kvart ett rör och placera dem i 3D-utskrivna rack, med början med position A1 i rack ett.

Fyll varje rack från vänster till höger och uppifrån och ned. Fortsätt detta lastmönster i rack två och fortsätt sedan till rack fyra och fem. Placera laddade kvarts ett provställ på däck ett, två, fyra, fem, sju, åtta, 10, 11.

Placera P20-tips på däck tre och nio. För att förenkla installationsprocessen, ladda material från baksidan till framsidan in i roboten. Master mixplattorna tillverkas på en dedikerad robot och lagras vid fyra grader Celsius.

En platta används i taget och är märkt med plåtnamn, och ett vasst blad används för att skära en linje i folien runt kontrollbrunnarna. Placera huvudblandningsplattan på däck sex och skala bort foliekåpan och lämna kvar den lilla rektangeln som täcker kontrollbrunnarna. Upptäck tipslådorna och stäng roboten.

Initiera det anpassade Python-driftsprotokollet genom att klicka på startkörning genom robot skrivbords programmet. Varje kvartal tar 24,5 minuter att ladda på plattan. Ställ in en timer som en påminnelse.

Medan roboten är igång, lossa och ladda kvarts två provrör i den andra uppsättningen 3D-utskrivna rack. När roboten pausar tar du bort kvarten ett rack och ersätter dem med kvarts två rack och klickar sedan på fortsätt köra i skrivbordsprogrammet. Recap kvartal ett provrör och förvara dem i ett fyra grader Celsius kylskåp i väntan på resultat.

Upprepa denna laddningsprocess för kvartal tre och fyra. Överför den laddade plattan till ett biosäkerhetsskåp. För att minimera kontaminering, håll plattan täckt under överföringen.

Samla in eventuella upprepade exempel och tilldela dem som de sista exemplen i kvartal fyra. Numrera exemplen, skanna streckkoderna och ange den ursprungliga exempelplatsen och resultatet i exempelinläsningskalkylbladet. Överför de upprepade proverna till biosäkerhetsskåpet.

Ladda inte de upprepade provrören i robotens lastställ. Pipettera två mikroliter av varje upprepat prov till rätt brunnar. Använd den utsedda pipetten för att lägga till patientprover.

Håll kontrollbrunnarna täckta med folie samtidigt som du lägger till prover för att minimera föroreningen. Skala bort folieskyddet över kontrollbrunnarna med tång. Pipetten två mikroliter av bekräftade positiva patientprover i brunnarna M23 och M24.

Pipettera två mikroliter av nukleasfritt vatten till brunnarna N23 till N24 och två mikroliter på 200 kopior per mikroliter blandad positiv kontroll till Wells O23 till O24. Lämna brunnarna P23 till P24 tomma för att övervaka huvudblandningens batchkvalitet. Täck plattan med en optiskt klar tätning och använd applikatorrullen för att fästa tätning vid alla brunnar.

Virvla plattan vid 2 500 RPM i 30 sekunder för att blanda ordentligt och centrifugera sedan plattan vid 500 gånger G i en minut. Välj protokollprogrammet i termocykelprogramvaran och spara protokollet för framtida plattor. Placera den förseglade plattan i termocykeln och kör protokollet.

Exportera CT-värden och kopiera värdena till exempelinläsningskalkylbladet. För positiv kontroll, kontrollera om minst en positiv kontrollbrunn producerar CT-värden mellan 22 och 28 för både P1- och N1-sonder. Alternativt producerar de kända positiva provbrunnarna P1- och N1 CT-värden mindre än 33 på P1- och N1-sonder.

För negativ kontroll kontrollerar du att det inte finns några N1- eller P1 CT-värden i någon av de två negativa kontrollbrunnarna. Bekräfta att CT-värden har giltiga förstärkningskurvor innan plattan ogiltigförklaras. Om P1 ger ett resultat av CT mindre än 33, betrakta brunnen som giltig och fortsätt att resultera från N1. Om P1 ger ett resultat av CT som är större än eller är lika med 33 eller inget CT-värde, betrakta det som ogiltigt.

Om N1 ger ett resultat av CT mindre än 33, utvärdera brunnen och ja. Om N1 inte producerar ett CT-värde, utvärdera brunnen som nej. Om N1 producerar ett CT-värde som är större än eller är lika med 33, bedöm brunnen som ingen stjärna.

Bekräfta att alla N1 CT-värden är associerade med en verklig förstärkningskurva. Om ett CT-värde för N1 inte har någon förstärkningskurva är brunnen nej. Identifiera upprepningsproverna, märka dem med ett internt exempelnummer och exempeltyp och returnera dem till inläsningsarbetsflödet.

De representativa bilderna visar RTQ PCR-detektering av N1 eller SARS CoV-2 syntetiskt RNA och P1 eller HSRPP30 syntetiskt DNA. Standardkurvor ritades med standardavvikelser för att bestämma området för exakt detektion med hjälp av denna sondprimerkombination. De genomsnittliga CT-värden som erhållits i respektive utspädning plottades mot den uppskattade mängden syntetiskt RNA och syntetiskt DNA.

I båda fallen visade de linjära kurvorna bra korrelationskoefficienter över ett brett spektrum av genkopior koncentrationer. N1 CT-värden som erhållits från unika prover med hjälp av både roboten och manuell provbelastning överfördes för att bestämma interanalysvariationen mellan manuell och robotbelastning. Det linjära förhållandet mellan manuella och automatiserade metoder gav en hög korrelationskoefficient som indikerar att båda metoderna är funktionellt likvärdiga.

Intraanalysvariationen fastställdes också med hjälp av transponerade replikativa N1 CT-värden som erhållits från både roboten och manuell provbelastning. Utvärdering av värmebehandlingsmetoder för viskositetsreduktion i saliven visas här. SARS CoV-2 negativt saliv samlades in från en enda källa och alikvoter värmebehandlades i antingen noll minuter, 30 minuter eller 60 minuter vid 95 grader Celsius.

P1 CT värden från tekniska replikat av varje villkor ritades för att fastställa variabiliteten mellan behandlingsmetoderna. Både 30 minuter och 60 minuters värmebehandlingsmetoder producerade signifikant minskad provvariation jämfört med ingen behandlingskontroll. det fanns ingen signifikant skillnad mellan 30 minuter och 60 minuters behandlingar.

Därför genomfördes 30 minuters värmebehandlingsmetod för att minska bearbetningstiden. Använd rätt aseptisk teknik för att minimera föroreningen av testplattorna, särskilt vid lastning av manuella prover och kontroller. Undvik att korsa plattan med händer eller ärmar.

När kliniska resultat har producerats kan prover kasseras i biologiskt farligt avfall eller sparas för ytterligare analys, såsom helgenomsekvensering för att bestämma specifika stammar. Denna teknik möjliggör storskalig samhällstestning, vilket gör det möjligt för oss att undersöka effekterna av testtäckning och den icke-symptomatiska spridningen av Covid 19.