Strukturbaseret simulering og prøveudtagning af transkriptionsfaktorproteinbevægelser langs DNA fra atomskala trin til grovkornet diffusion

Målet med denne protokol er at afsløre strukturel dynamik af endimensionel diffusion af protein langs DNA ved hjælp af en plantetranskriptionsfaktor WRKY domæneprotein som et eksemplarisk system. De atomare simuleringer under Markov-statsmodelkonstruktionen afslører 1-bp trinbevægelser af protein langs DNA ved atomare detaljer. Mens de grovkornede simuleringer fokuserer på prøveudtagning af proteinprocessive diffusioner over 10 bps langs DNA.

Til at begynde med skal du bruge en 10 mikrosekunders MD-bane med alt atom til at udtrække 10.000 billeder jævnt fremad, en basepar-trinsti. Forbered overgangsstien med 10.000 billeder i VMD ved at klikke på Filer og Gem koordinater. Skriv derefter protein eller nuklein i feltet Valgte atomer.

Vælg Rammer i feltet Rammer, og klik på Gem for at få de nødvendige rammer. Juster referencens lange akse fra DNA’ets krystalstruktur til x-aksen, og indstil det oprindelige massecenter for det fulde 34 basepar DNA ved oprindelsen af koordinatrummet ved at klikke på Udvidelser og derefter vælge TkConsole i VMD. Skriv derefter kommandoen i kommandovinduet TkConsole.

Beregn derefter roden betyder kvadratisk afstand af proteinrygraden ved at klikke på VMD, gå derefter til Udvidelser, klikke på Analyse og vælge RMSD Trajectory Tool. I atomudvælgelsesboksen skal du skrive nuklein og rest 14 til 23 og 46 til 55. Klik på ALIGN og derefter RMSD box.

For at beregne rotationsgraden af protein omkring DNA theta T, med den oprindelige vinkelpositionering defineret som theta 0, på XY-planet i MATLAB, skal du udføre kommandoen. Indtast instruktionerne i MATLAB for at bruge K-means metoder, og klassificer de 10.000 strukturer i 25 klynger. Når det er gjort, skal du samle strukturerne i de 25 klyngecentre til yderligere MD-simulering.

For at gennemføre den første runde MD-simulering skal du opbygge et atomistisk system til de 25 strukturer ved hjælp af GROMACS og build-systemet sh-filen. Udfør 60 nanosekunder MD-simuleringer for de 25 systemer under NPT-ensemble med et tidstrin på to femtosekunder ved at behandle kommandoen i skal. For at samle de første runde MD-baner skal du fjerne de første 10 nanosekunder af hver simuleringsbane og indsamle bekræftelser fra de 25 gange 50 nanosekunds baner.

For den tiduafhængige komponentanalyse skal du indtaste scriptet i GROMACS efterfulgt af at vælge afstandspar mellem protein og DNA som inputparametre projektion. Fra indekset. ndx-fil, til et nyt tekstfilindeks.dat.

For at få paroplysningerne mellem disse atomer skal du bruge Python-scriptet. Beregn de 415 afstandspar fra hver bane i MSMBuilder-kommandovinduet. Udfør derefter en tiduafhængig komponentanalyse for at reducere dimensionen af data til de første to gange uafhængige komponenter eller vektorer ved at udføre kommandoen.

Ved behandling af instruktionen i MSMBuilder skal du gruppere de projicerede datasæt i 100 klynger ved hjælp af casecentermetoden og vælge centerstrukturen for hver klynge. For at udføre anden runde MD-simulering skal du udføre 60 nanosekunders MD-simuleringer startende fra de 100 indledende strukturer. Efter at have pålagt tilfældige starthastigheder på alle atomerne, skal du tilføje de tilfældige starthastigheder ved at tænde hastighedsgenereringen i MDP-filen.

Fjern de første 10 nanosekunder af hver simulering som beskrevet tidligere. Og saml 2.500.000 snapshots fra de 100 gange 50 nanosekunds baner, jævnt, for at konstruere MSM. For at gruppere anden runde MD-baner skal du udføre den tiduafhængige komponentanalyse for anden rundes baner i MSMBuilder som vist.

Og beregn den underforståede tidsskala for at validere parametre ved at udføre Python-scriptet. Varier derefter forsinkelsestiden tau og mikrotilstandsnummeret ved at ændre parametrene. Klassificer bekræftelserne i 500 klynger ved at udføre kommandoen.

For MSM-konstruktion skal de 500 mikrostater klumpes sammen i tre til seks makrostater. For at finde ud af antallet af makrotilstande, der passer bedst, ifølge PCCAplus-algoritmen i MSMBuilder ved hjælp af Python-scriptet. Kortlæg de højdimensionelle bekræftelser til X og rotationsvinklen af proteinet langs DNA’et for hver mikrotilstand.

For at beregne de gennemsnitlige første passagetider skal du udføre fem Monte Carlo-baner på 10 millisekunder baseret på overgangssandsynlighedsmatrixen for 500 mikrotilstands MSM med forsinkelsestiden på 10 nanosekunder indstillet som Tidstrinnet for Monte Carlo. Beregn gennemsnitlige første passagetider mellem hvert par makrotilstande i Python-scriptet og gennemsnittet af standardfejl for de gennemsnitlige første passagetider ved hjælp af Bash-filen. I CafeMol 3.0-softwaren skal du køre den kursuskornede simulering ved at udføre kommandoen på terminalen.

Når du har angivet blokkene i inputfilen, skal du indstille filnavneblokken og job_cntl blok med de enkelte kommandoer. Indstil derefter unit_and_state blokken efterfulgt af indstilling af energy_function-blokken og md_information-blokken. Alle proteinbekræftelser på DNA’et blev kortlagt til proteinets langsgående bevægelse X og rotationsvinkel langs DNA, som yderligere kan grupperes i tre makrotilstande.

S1-tilstanden er mindre gunstig, da hydrogenbindingerne ligner den modellerede struktur, mens S3 refererer til en metastabil tilstand, hvor alle hydrogenbindingerne skiftede efter et basepar-trin og syntes stabile med den højeste befolkning på 63%Den mellemliggende tilstand S2 forbinder S1 og S3 med en medium høj befolkning på 30%Overgangen fra S2 til S3 tillader kollektiv brud og reformering af hydrogenbindingerne i cirka syv mikrosekunder, mens S1 til S2 overgang kan forekomme i ca. 0,06 mikrosekunder. Kontaktnumrene mellem protein og DNA blev beregnet, og fire tilstande blev identificeret. I tilstande 1 og 3 binder zinkfingerområdet sig mod Y-retningen.

Mens zinkfingerområdet i stater 2 og 3 binder mod Y-retningen. Trinstørrelsen for hver konserveret rest på forskellige sekvenser af DNA blev målt, hvilket afslørede, at trinstørrelserne af disse rester er mere synkroniseret på polyA-DNA end på polyAT eller tilfældige DNA-sekvenser. De vigtige trin i Markov-statsmodelkonstruktionen er at vælge afstandspar mellem protein- og DNA-datareparationer i 1-bp-trinbevægelserne og udvælgelsen af et passende antal mikrotilstande og makrotilstande.