1,417 Views
•
07:17 min
•
October 28, 2022
DOI:
Detta protokoll använder ett nytt tillvägagångssätt för provtagning av korionen från kläckt fjäril ovi för genetisk analys. Det kan vara särskilt användbart när andra vävnadsprovtagningstekniker är opraktiska, otillgängliga eller inte tillåtna. Detta protokoll har en relativt låg totalkostnad med hjälp av lätt att skaffa förnödenheter och riktar sig mot kvarvarande organiskt material som eliminerar behovet av att tillfälligt fånga eller manipulera och potentiellt skada levande organismer för att förvärva genetiska prover.
Det övergripande protokollet är enkelt och lätt att lära sig, men kräver fingerfärdighet och strikt uppmärksamhet på detaljer, särskilt för att framgångsrikt hitta, identifiera och ta bort mycket små målprover för att undvika korskontaminering mellan provinsamlingshändelser. Börja med att noggrant granska och samla in den fullständiga listan över insamlingsrelaterade förnödenheter som behövs. Om provinsamling sker på flera platser eller av flera individer eller team, samla och organisera alla förnödenheter som behövs i separata distribuerbara enheter.
Transportera förnödenheter till samhällsforskare eller annan personal som ansvarar för fältinsamling. Om personalen inte är lokal, packa försiktigt förnödenheter i en separat kartong med en komplett fraktetikett och skicka dem. Vid mottagande av insamlingsmaterial inklusive insamlingslådan, granska noggrant den laminerade leveranslistan och gör en fullständig inventering.
Meddela projektledaren om några förnödenheter saknas. Förfyll 1,5 ml mikrocentrifugrör med 180 mikroliter lysbuffert. Applicera en förtryckt unik ID-etikett på varje mikrocentrifugrör och placera alla rör i 64-brunns mikrocentrifugrörsförvaringslådan.
Säkra locket ordentligt efter lastning. Se till att all digital utrustning är fulladdad och att eventuella reservbatterier är packade. Fyll delvis en liten kylare med is för fältlagring och lokal transport av de insamlade proverna.
Packa alla insamlingsmaterial i insamlingslådan eller liknande robust väderbeständig behållare för säker transport och konsoliderad lagring. Granska det icke-destruktiva genetiska provsamlingsprotokollet och detaljera innan du går in i fältet. När du anländer till fältplatsen, använd en penna eller all väderpenna för att registrera tid på dagen, datum, övergripande fastighetsnamn, specifikt fältplatsnamn eller beskrivning, GPS-läsning om tillgängligt och fullständigt namn och roller för alla individer som finns i den väderbeständiga fältanteckningsboken.
Lokalisera en lämplig livsmiljö för närvaron av en larvvärdväxt till den artspecifika målfjärilen. Använd en smartphone eller kamera och ta detaljerade fotografier av alla fältplatser, provtagningsplatser, värdväxter och annan relevant information. Använd smartphones eller andra kameror som spelar in GPS-koordinater.
Sök omfattande alla larvvärdväxtdelar som löv, blomknoppar, blommor eller utvecklande frukt som är kända för att väljas av ägg-positing vuxna kvinnliga fjärilar för kläckta ägg. För de flesta Lycaenidae, leta efter vita kläckta ägg med ett distinkt hål i mitten som liknar en munk från vilken den nyfödda larven kom fram. Leta efter oskadade ägg som är mörkare i färgen, ofta gröna eller blåaktiga, och kommer att vara helt intakta utan ett hål i mitten.
När ett kläckt ägg är beläget, använd nitrilhandskar. Använd sterila och spetsiga pincett, ta tag i och dra försiktigt det kläckta ägget från värdväxten och placera det direkt i ett märkt mikrocentrifugrör förfyllt med lysbuffert. På samma sätt kan andra vävnadsprover användas och bearbetas.
Se till att allt uppsamlat material är helt nedsänkt i lysbufferten i varje 1,5 ml mikrocentrifugrör. Knacka på rörets botten på en hård yta för att sänka ner eventuella prover om det behövs. När du samlar in ett nytt prov, kassera använda nitrilhandskar och byt ut dem med ett rent par.
Efter varje ägguppsamling, rengör försiktigt pincettspetsarna genom att doppa eller dousing dem i en injektionsflaska med 95% etanol från en pressflaska eller använda alkoholservetter. Samla in minst fem prover per värdväxtplåster per plats, där varje prov innehåller ett till 20 ägg, med sikte på mer än 50 ägg totalt på en plats om sådan finns. Samla ett till 20 kläckta ägg från flera växter i samma värdplåster i ett enda mikrocentrifugrör och stäng locket ordentligt.
För fjärilsarter som använder större örtartade eller träiga värdarter, samla flera ägg från olika platser på samma växt om värdlapparna är begränsade. I den väderbeständiga fältanteckningsboken registrerar du den tilldelade unika ID-etiketten tillsammans med typen av prov, det ungefärliga antalet kläckta ägg och insamlingsinformation. Placera det slutna mikrocentrifugröret med äggskräpprovet tillbaka i 64-brunns mikrocentrifugförvaringslådan.
Förvara förvaringslådan i en kylare med is när du är i fältet. Lägg alla andra insamlingsmaterial i insamlingslådan för säker och konsoliderad lagring och transport mellan platser. Av dessa 160 prover extraherades DNA framgångsrikt från 88 med en genomsnittlig koncentration på 1,67 nanogram per mikroliter och det högsta DNA-utbytet var 26,8 nanogram per mikroliter.
DNA-koncentrationer efter vävnadstyp bekräftade att proverna som innehöll ett enda äggskräp endast hade ett äggfall och prover som innehöll flera äggfall hade minst två fall med antalet fall från två till 20, i genomsnitt 5,3 per prov. Material för att samla upp till 563 prover skickades till åtta bevarande- och samhällsforskare från nio stater över artområdet i östra Nordamerika. Material skickades ut under tre månader under 2021 före lokala rusningstider.
Totalt har 160 Calephelis iris vävnadsprover mottagits. Det är viktigt att minimera korskontaminering mellan proverna, se till att det insamlade provet är helt nedsänkt i lysbufferten och noggrant registrera den unika ID-etiketten och insamlingsdata för varje prov. Detta protokoll möjliggjorde bred distribution och användning av samhällsforskare för att icke-destruktivt prova befintliga populationer av en sällsynt fjäril för att hjälpa till att genomföra en bred genetisk strukturanalys.
Här presenterar vi ett enkelt protokoll för icke-invasiv genetisk provtagning av fjärilspopulationer baserat på fältinsamling av kvarvarande äggskräp. Den kan användas för att bekräfta artens identitet och kvantifiera genetisk variation. Detta protokoll kan enkelt anpassas till bredare grupper för samhällsvetenskapligt engagemang.
Read Article
Cite this Article
Daniels, J. C., Storer, C. G., Hill, G. M., Markee, A., Couch, C., Rossetti, K. A. Deploying Community Scientists to Conduct Nondestructive Genetic Sampling of Rare Butterfly Populations. J. Vis. Exp. (188), e63416, doi:10.3791/63416 (2022).
Copy