Utvikling av organoider fra mus hypofyse som in vitro modell for å utforske hypofysen stamcellebiologi

Vår organoide modell er svært verdifull for å utforske hypofyse stamcellebiologi i homeostatisk samt hypofyse ombyggingsforhold, for eksempel i neonatal modning av kjertelen, aldringsrelatert funksjonell nedgang og tumorvekst i kjertelen. Til dags dato er vår hypofyse organoid teknikk det eneste tilgjengelige verktøyet for pålitelig og robust å vokse og utvide primære mus hypofyse stamceller. Å demonstrere prosedyren vil være Emma Laporte og Charlotte Nys, ph.d.-studenter i min forskningsgruppe.

Til å begynne med, vask musehodet med deionisert vann for å fjerne blodet. Spray 70% etanol på hodet for å generere et sterilt miljø. Fjern deretter huden mellom ørene ved hjelp av sterile kirurgiske verktøy.

For å åpne kraniet, bryt nesebroen med steril saks. Åpne kraniet ytterligere fra nesebroen mot ørene på begge sider. Fjern kraniet og hjernen med sterile pinsett uten å berøre hypofysen.

Fjern diafragma sellae med stump pinsett. Deretter, under et stereomikroskop, skille den fremre lobe fra bakre og mellomliggende lobes. Isoler forsiktig den fremre lobe med stump pinsett og samle den i en 10 milliliter Erlenmeyer kolbe som inneholder tre milliliter middels A.Tilsett to milliliter forvarmet 2,5% trypsinoppløsning.

Inkuber ved 37 grader Celsius i 15 minutter. Tilsett to milliliter forvarmet DNAse-løsning og virvle Erlenmeyer-kolben 10 ganger. La hypofysen synke til bunnen og fjern supernatanten.

Tilsett to milliliter forvarmet trypsinhemmerløsning og inkuber ved 37 grader Celsius i 10 minutter. Fjern supernatanten når hypofysen synker til bunnen. Tilsett to milliliter forvarmet medium B og inkuber i fem minutter.

Tilsett to milliliter forvarmet medium C til dette og inkuber i 15 minutter. La hypofysen synke til bunnen og fjern supernatanten. Skyll den deretter tre ganger med forvarmet medium C.Tilsett to milliliter forvarmet medium C.Aspirate og utvis hypofysen med en steril, flammepolert Pasteur pipette flere ganger til fragmenter ikke er synlige lenger.

Overfør suspensjonen til et 15 milliliter rør som inneholder 4,5 milliliter forvarmet DNAse-løsning. Skyll kolben tre ganger med to milliliter forvarmet medium C og overfør suspensjonen til røret. Bland den oppsamlede cellefjæringen og filtrer den gjennom en 40-mikron cellesil i et 30 milliliterrør.

Skyll røret og cellesilen tre ganger med to milliliter middels C og overfør suspensjonen til røret. Fyll en pasteurpipette i glass med to milliliter BSA. Plasser tuppen av pipetten nederst på røret og rør forsiktig ut for å danne et synlig tetthetslag.

Sentrifuge ved 190 ganger G i 10 minutter ved fire grader Celsius. Fjern supernatanten og resuspend cellepellet i en milliliter iskald avansert DMEM / F-12. Deretter kvantifiserer du cellene med en celleteller.

Sentrifuger cellefjæringen ved 190 ganger G i 10 minutter ved fire grader Celsius og fjern supernatanten. Resuspend cellepellet i avansert DMEM / F-12 for å nå en celletetthet på 1,1 ganger 10 til sjette celler per milliliter. Legg ECM til ønsket volum av celleoppheng med et forhold på 30:70 og bland godt.

Deponer en 30-mikroliter dråpe av denne blandingen i hver brønn av en forvarmet 48-brønns plate. Snu platen opp ned og la ECM størkne ved 37 grader Celsius i 20 minutter. Etter inkubasjonen, tilsett forsiktig 250 mikroliter av forvarmet hypofyse organoid medium supplert med 10-mikromolar ROCK-hemmer.

Hver annen til tre dager, bytt mediet uten ROCK-hemmer i 10 til 14 dager til organoidene er fullt vokst. For å passere organoidene aspirerer du først mediet forsiktig og tilsetter 400 mikroliter iskald avansert DMEM / F-12 for å oppløse ECM. Samle deretter organoidene i et mikrocentrifugerør.

Vask brønnen med 400 mikroliter iskald avansert DMEM/F-12. Sentrifuger røret ved 200 ganger G i fem minutter ved fire grader Celsius. Fjern supernatanten og tilsett 400 mikroliter forhåndsvarmet TrypLE Express-enzym.

Bland ved å invertere røret flere ganger og inkubere ved 37 grader Celsius i fem minutter. Tilsett 400 mikroliter iskald avansert DMEM/F-12. Sentrifuge ved 200 ganger G i fem minutter ved fire grader Celsius og fjern supernatanten.

Resuspend pellet med 100 mikroliter av iskald avansert DMEM / F-12. Smal en P-200 spiss og bruk spissen til å fjerne organoidene ved kraftig pipettering til organoidfragmenter er oppnådd. Tilsett 800 mikroliter avanserte DMEM/F-12.

Sentrifuge ved 190 ganger G i 10 minutter ved fire grader Celsius og fjern supernatanten. For å passere organoidene, resuspend pellet i et tilstrekkelig volum av avansert DMEM / F-12 og legg til ECM i et forhold på 30:70. Bland godt.

Fortsett å frø og kultur organoidene som beskrevet i tekstmanuskriptet. Dissosierte enkeltceller fra den fremre loben ble sådd i ECM og dyrket i hypofysen organoid medium. 14 dager etter sådd ble organoidene fullt utviklet og nådde en diameter på opptil 500 mikrometer.

På dette stadiet viste organoidene cystisk morfologi med et epitellag som omslutter en lumen. Det anbefales ikke å bruke brønnene der tette strukturer vises etter vekst. For passivring ble organoidfragmenter brukt til såing.

Syv dager etter passivitet ble gunstig organoid gjenvekst observert med cystiske strukturer. Tette organoider bør kastes, da de ugunstige organoidene kan overta kulturen. Immunfluorescensfargingsanalyse for epitelmarkørene E-kadherin og cytokeratiner 8 og 18 bekreftet organoidenes epitelkarakter.

Uttrykk for hypofyse stamcellemarkører Sox2 og Trop2 demonstrerte stemness, og hypofysespesifikk markør LHX3 viste hypofyse fenotype av organoidene. Uttrykk for markøren Ki67 viste at de organoidkonstituerende cellene er i proliferativ tilstand. RTQ PCR-analyse viste høyere uttrykk for stemnessmarkører i organoidene enn i den fremre lobe selv etter flere passasjer, og validerte berikelsen av stamceller.

Det er viktig å plate riktig antall enkeltceller i ECM-kuppelen ved første sådd, og når man passerer organoidene, må man huske å re-frøfragmenter og ikke enkeltceller.