Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Dobbel fargingsmetode for å oppdage pektin i plantesvampinteraksjon
Chapters
Summary February 4th, 2022
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Denne protokollen beskriver en mikroskopisk metode for å oppdage pektin i kaffe-sopp interaksjon.
Transcript
Denne protokollen er viktig da den gjør det mulig å identifisere plantesopp samspillet. I tillegg til å fargelegge pektinet, demonstrerer det også feil på patogencelleveggpolymeren og tillater identifisering av soppstrukturer. Denne enkle og ukompliserte teknikken kan utføres ved hjelp av lysmikroskopi, og det krever ikke noe dyrt utstyr som skanning av elektronmikroskop.
I tillegg er det en rask teknikk som oppnår et utmerket skille mellom plantestrukturer for histopatologiske studier. Teknikken identifiserer plantesoppinteraksjonen. Derfor samarbeider det for å diagnostisere sykdommene forårsaket av biotrofiske og nekrotrofiske sopp som kaffe rust og cercosporiosis.
For å begynne, høst og ca 10 kvadrat millimeter bladprøve i midten av lesjonen ved hjelp av en skalpell og pinsett, og senk den i 30 milliliter Karnovsky fixative løsning. Underkast bladprøven til et lavt vakuum på 500 til 600 millibar i 15 minutter ved hjelp av en oljepumpe, minst fire ganger for å øke permeabiliteten til den fikseringsløsningen i bladvevet. Etter fiksering, vask bladprøven tre ganger i 0,5 M kaktokylatbuffer fortynnet i destillert vann i fem minutter hver, og overfør den deretter til en gradert etanolserie i 15 minutter ved hver etanolkonsentrasjon.
For gradvis å overføre prøvene til glykolmetakrylat, gjør løsning A ved å blande det ene gram glykolmetakrylatpulver med 100 milliliter grunnleggende harpiks under magnetisk agitasjon. Senk deretter prøvene i forholdet en til to av løsning A og 100% etanol i tre timer. Senk prøvene i forholdet en til en for løsning A: 100% etanol i tre timer, deretter nedsenket i en ren grunnleggende harpiks i to til fire dager.
Utsett prøven til et lavt vakuum minst fire ganger om dagen i 15 minutter, etterfulgt av rotasjon. Bland 15 milliliter oppløsning A med en milliliter herder i et beger med rotasjon i to minutter for å produsere polymerisasjonsløsningen B.Put 1,2 milliliter av denne polymerisasjonsløsningen B i plastformer. Bruk en treplukk, overfør de lesjonerte bladprøvene fra ren grunnleggende harpiks til løsning B og unngå å bruke pinsett, da de kan forårsake vevsknusing.
Sørg for å raskt orientere bladprøver vinkelrett på plastformene, da løsning B raskt blir viskøs. Når bladprøvens vinkelrette orientering oppnås, vent i 30 minutter og overfør deretter plastformen til et plast- eller glasskammer som inneholder silikagel for å forhindre fuktighet. Når harpiksen og bladprøven er polymerisert etter to til tre timer, løsner du den resulterende blokken fra plastformen ved å slipe blokkbasen med en slipefil.
Lim deretter blokken til et trestykke. Klipp blokken i fem mikrometer tykke seksjoner ved hjelp av en roterende mikrotom utstyrt med åtte centimeter stålblader. Plasser seksjonene på glasssklier dekket med destillert vann.
Overfør deretter lysbildene til en varm plate for å tørke ved 40 grader Celsius og fremme vedheft av seksjonene til glasssklier. Etter tørking merker du glasslysbildene med blokkreferansenavnet og lysbildenummeret. Dekk seksjonene med to milliliter 5% bomullsblå i laktiofenol og varm dem på en varm tallerken ved 45 grader Celsius i fem minutter.
Fjern overflødig fargestoff ved å vaske lysbildet tre ganger i et beger fylt med destillert vann. Flekk den med to milliliter 0,01% ruthenium rød i vann i ett minutt. Fjern overflødig fargestoff ved å vaske lysbildet tre ganger i et beger fylt med destillert vann.
Sett en dråpe destillert vann over seksjonene og dekk seksjonene med en dekselslipp for å utføre lysmikroskopianalyse. I den doble fargingsmetoden virket Hemileia vastatrix hyphae som inneholder cellevegger og det tette protoplastinnholdet mørkeblått i både svampete og palisadeparenchyma. Haustorium-modercellen og haustoria viste også en mørk blå farge.
Motfargingen med ruthenium rød klart definert soppfordeling i intercellulære rom. Under samspillet brøt Hemileia vastatrix haustorium modercelle vertscelleveggen og utviklet en haustorial nakke omgitt av pektiske forbindelser. Den pektinrike rosa-røde fargede innkapslingen av haustorialhalsen kan ikke forhindre haustorial dannelse.
I noen tilfeller innkapslet den pektinrike innkapslingen haustoriumet ufullstendig. Og i noen tilfeller er haustoriumet fullt innkapslet. Den pektinrike celleveggen opprettholder integriteten ved lesjonsgrensen, hvor soppen ikke er til stede.
Den doble fargingsmetoden viste tilstedeværelsen av intercellulær hyphae. I interaksjonssoner så pektincellevegger ut til å miste sin integritet på grunn av oppløsning. Reproduktive strukturer som conidia ble funnet i adaxial epidermis.
Cercospora coffeicola hyphae ble funnet i det substomatiske kammeret som curling strukturer, og palisade parenchyma i lesjonsregionen ser ut til å gjennomgå cellevegg lysis. Unngå å bruke pinsett, da de kan forårsake vevsknusing. Ytterligere histopatiske studier på rust, antracnose, cercosporiosis, smuts og andre biotrofiske, hemibiotrofiske og nekrotrofiske plante-sopp interaksjoner bør utføres for å undersøke potensiell bruk av denne teknikken i forskjellige patosystemer.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
