Environment
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Inokuleringsstrategier för att infektera växtrötter med jordburna mikroorganismer
Chapters
Summary March 1st, 2022
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Detta protokoll presenterar en detaljerad sammanfattning av strategier för att inokulera växtrötter med jordburna mikrober. Exemplifierat för svamparna Verticillium longisporum och Verticillium dahliae beskrivs tre olika rotinfektionssystem. Potentiella tillämpningar och möjliga nedströmsanalyser lyfts fram, och fördelar eller nackdelar diskuteras för varje system.
Transcript
Även om otaliga mikrober koloniserar växtrötter är dessa interaktioner svåra att analysera när de händer under jord. För att underlätta detta ger denna protokollsamling en översikt över strategier för att inokulera växtrötter med jordburna mikrober. Rotinokulering är grunden för att studera rotmikrobinteraktioner, och genom att använda följande tekniker kan interaktioner studeras på molekylär, cytologisk eller histologisk nivå.
Vi förklarar tre inokuleringssystem som använder verticillium som rotinkräktande mikrob, och modellväxten, arabidopsis. Överföring av metoderna till andra växter som tomat eller raps och till andra rotmikrober, till exempel fördelaktig serendipita, är dock möjlig. Förbered verticillium inoculum i förväg genom att odla mycelien i PDB och inducera sporulering och Czapek dextrosbuljong.
Börja sedan med att hälla det autoklaverade mediet i petriskålar. Efter härdning av mediet, packa om petriskålarna i en steril plastpåse och förvara dem upp och ner över natten i kylen vid fyra till 10 grader Celsius. Skär och ta bort en infektionskanal i den övre tredjedelen av det stelnade mediet med en skalpell.
Undvik att få vätska eller luft under agarmediet under skärning. Använd sedan en steril pipettspets för att fördela 50 till 100 ytsteriliserade arabidopsisfrön på den skurna övre ytan. Sätt fröna i vinkeln där den skurna agarytan kommer i kontakt med petriskålens vägg så att rötterna kan växa mellan dem.
Stäng petriskålarna och försegla dem med en tejp som andas för att möjliggöra gasutbyte. Håll petriskålarna i mörkret vid fyra grader Celsius i två dagar för stratifiering för att säkerställa synkroniserad och effektiv spiring. Placera sedan plattorna vertikalt i ett ställ och odla växterna i en tillväxtkammare under långa dagsförhållanden.
Efter nio till 11 dagar när rötterna når infektionskanalen, lägg plattorna horisontellt och öppna dem. Tillsätt sedan 500 mikroliter nyskördad Verticillium conidia direkt i infektionskanalen. Förbered kontrollplattor genom att tillsätta 500 mikroliter av en mock lösning istället för sporer.
Inkubera både kontroll- och sporokulerade plattor horisontellt tills vätskan har blött in. Stäng sedan locket och försegla plattorna med tejp som andas. Täck rotdelarna med svarta papperslådor för att mörka rötter och jordburen svamp.
Inkubera plattorna vertikalt i tillväxtkammaren. Utför analyserna vid de föredragna tidpunkterna efter ympning. Sterilisera först transparenta 500 ml plastkoppar i 70 till 75% etanolbad i 20 minuter.
Torka kopparna i laminaflödeshuven. Häll det autoklaverade mediet i plastkopparna. Förbered ett plastskikt med fem prefabricerade hål, ett stort i mitten och fyra mindre i varje hörn.
Placera plastskiktet på mediet innan det stelnar. Skär agaren med en skalpell genom det prefabricerade mitthålet till ett djup av ca 1,5 centimeter. Ta bort den skurna agaren för att skapa en infektionskanal för att lägga till svampsporerna senare.
Skrapa agarmediet något med en pipettspets i de fyra mindre hålen för att avbryta den stelnade huden. Placera fröna med en pipettspets i de mindre hålen. Stäng plastkoppen med en andra inverterad plastkopp och försegla med tejp som andas.
Håll växterna vid fyra grader Celsius i tre dagar i mörkret för stratifiering. Inkubera sedan koppsystemen i tillväxtkammaren. För att inokulera plantlets med verticillium, tillsätt en milliliter konidialösning i infektionskanalen.
För kontroller, tillsätt en milliliter bakteriefri en fjärdedel MS-medium som en mock lösning. Utför analyserna vid de föredragna tidpunkterna efter ympning. Blanda först jord och sand noggrant i ett tre till ett volymetriskt förhållande som underlättar tvättning av substratet från rötterna senare.
Häll blandningen i en autoklavpåse och ånga vid 80 grader Celsius i 20 minuter i en autoklav. Fyll krukor med jord-sandblandningen och överför dem till brickor. Tillsätt vatten i brickorna ungefär en tredjedel av höjden på en kruka för enhetlig blötläggning av jord-sandblandningen.
Vattenspray blandningen för att säkerställa våta startförhållanden. Så tre till fyra frön i varje kruka på tillräckligt avstånd från varandra. Förvara dem för stratifiering vid fyra grader Celsius i tre dagar i mörkret.
Låt plantorna växa under långa dagsförhållanden med regelbunden vattning, välj sedan växter av liknande storlek och ålder för att utföra rotdoppinokuleringen. Ta jorden ur krukorna och gräv rötterna. Tvätta försiktigt rötterna i en vattenbehållare och håll rosetterna ur vattnet.
Inkubera rötterna i 60 minuter i en petriskål som innehåller verticilliumsporlösningen eller mocklösningen. Förbered nya krukor med fuktig ångsteriliserad jord utan sand. Använd en pipettspets för att göra ett hål i mitten av jorden i varje kruka.
Placera rötterna direkt i hålet och fyll på hålen försiktigt med jord för att undvika ytterligare stress på växterna. Odla växterna under långa dagsförhållanden med regelbunden vattning. Utför analyserna vid de föredragna tidpunkterna efter ympning.
I det petriskålbaserade systemet visualiserades framgångsrik infektion av verticillium i arabidopsis rötter. Två dagar efter ympningen inducerades markörgenen MYB51 starkt i infekterade rötter jämfört med kontroll, vilket bekräftades genom QRTPCR-analys. I det koppbaserade systemet hittades en hög mängd svamp-DNA i bladen på infekterade växter som grafen visar i jämförelse med mock control efter 12 dagars ympning.
QRTPCR-analys visade berikad transkriptöverflöd av markörgenen MYB51 i arabidopsisrötterna. Med hjälp av detta system ympades verticillium till andra modellväxtarter. I raps var svamp-DNA detekterbart i stamsegment skurna vid basen av plantorna 12 dagar efter ympning vid rötterna.
Svamp-DNA detekterades också i tomatstammar som indikerar förökning av patogenen i växten. 21 dagar efter ympning med hjälp av det jordbaserade systemet såg rosetterna av mockbehandlade arabidopsisväxter friska och gröna ut medan infekterade växter visade gulaktiga eller nekrotiska blad och hade mindre grönt bladområde i förhållande till mock som indikerar framgångsrik infektion. Var uppmärksam när du skär infektionskanalen i Petri-skålsystemet för att förhindra att agaren glider.
Applicera det jordbaserade systemet, komprimera inte jorden runt rötterna medan du planterar om för att undvika ytterligare stress på växterna. Efter rotinokulering kan till exempel patogena tester, analys av genuttryck, funktionell genomik eller agrokemiska tester utföras som ger nya insikter i rotmikrobinteraktioner och verktyg för att förbättra jordbruket.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
