Bioprospektering av extremofile mikroorganismer for å håndtere miljøforurensning

Protokollen beskriver en strømlinjeformet tilnærming for screening og isolering av en tungmetallbestandig mikrober fra geotermiske fjærer. Denne tilnærmingen representerer et forskningsområde med økende interesse over hele verden for anvendelse innen biosensing og bioremediering. Metoden som beskrives der, kan enkelt modifiseres for å isolere mikrober fra forskjellige miljøkilder som vann, mat, jord eller sediment.

Den minimale hemmende konsentrasjonen for å identifisere en resistent mikrober er en rask strategi for å karakterisere de nye artene eller stammene. Denne protokollen er enkel å utføre og krever bare manuell dyktighet og erfaring med de grunnleggende mikrobiologiteknikkene. Til å begynne med inokulerer du to gram samlet prøve i 50 mikrolitter ferskt tilberedt Luria-Bertani-medium med en pH på fire eller syv.

Inkuber denne prøven ved temperaturen på prøvetakingsstedet pluss eller minus fem grader Celsius. Plate 200 mikroliter av prøven på Luria-Bertani agar med en pH på fire eller syv og hold den i statisk tilstand ved 55 eller 60 grader Celsius i 48 timer. Etter inkubasjonen isolerer du enkeltkolonier og gjentar denne strekbeleggsyklusen minst tre ganger.

For å forberede en milliliter frossen celle lager, legg 20% glyserol til over natten dyrkede celler. Bruk en blanding av aceton og tørris for rask frysing. For å forberede et inokulum fra en glyserolbestand, inokuler 50 mikroliter i 50 milliliter Luria-Bertani.

For å få en vekstprofil, fortynn denne prekulturen i 10 mikroliter Luria-Bertani. For å justere den optiske tettheten til 0.1, legg til 600 nanometer. Vokse disse cellene i 16 timer ved 55 eller 60 grader Celsius i orbital shaker.

Mål den optiske tettheten ved 600 nanometer med 30 minutters intervaller. Kurve fra disse dataene med tiden på X-aksen og optisk tetthet ved 600 nanometer på Y-aksen. Plott lignende vekstkurver med varierende pH i kulturmediet, for å bestemme den optimale pH for laboratorieforhold, Inokulate isolen strødd fra glyserolbestanden i 50 mikroliter Luria-Bertani medium og inkuber over natten.

Sentrifuger denne over natten dyrket kultur i 10 minutter på 5000 ganger G og kast deretter supernatanten og høst kulturpaletten. Forbered 10 milliliter bakterier lysis buffer sammensatt av 20 millimolar Tris-HCL, to millimolar EDTA, 1,2% Triton X-100 og 20 milligram per milliliter lysosom umiddelbart før bruk. Re-suspendere pellet i 180 mikroliter av bakterielyse buffer.

Genomisk DNA-ekstraksjon som instruert i rensesettet og måle genomisk DNA og dets renhet av UV-Vis. For å vurdere renhet, bestem 260 til 280 og 260 til 230 optiske tetthetsforhold. Vurder integriteten til det genomiske DNA ved å laste 200 nanogram av hver prøve på en 0,8% agarose gel og sammenligne størrelsesfordelingen med en høyde, vektmolekylær markør.

Dyrk isolasjonen fra glyserolbestanden i 200 milliliter Luria-Bertani optimal pH og temperaturforhold. Fortynn hver prekultur i fem milliliter Luria-Bertani medium i 50 milliliter polypropylenrør som inneholder økende konsentrasjoner av tungmetaller og antibiotika for å oppnå en optisk tetthet på 0,1 ved 600 nanometer. Vokse cellene i 16 timer på en orbital shaker med 180 omdreininger per minutt ved 55 eller 60 grader Celsius.

Beregn den minste hemmende konsentrasjonen for antibiotika eller tungmetaller ved å identifisere konsentrasjonsverdiene i rørene der mikrobiell vekst ikke forekommer. Kontroller at konsentrasjonen er hemmende og ikke dødelig for cellene ved å plate 200 mikroliter av kulturen som vokser i minst hemmende konsentrasjoner på Luria-Bertani agarplater og verifisere tilstedeværelsen av kolonier etter nattinkubasjon. Denne protokollen ble brukt til å teste bakterielle prøver fra Piscarelli-området, et syresulferisk geotermisk miljø Fenotypisk karakterisering av de isolerte mikroorganismer viste at isolasjon har en høyere toleranse for arsen og vanadate og er motstandsdyktig mot kadmium.

Sammenlignende data tyder på at isolere en har en sterk motstand mot pentavalent arsen, mens isolat to har motstand mot trivalent arsen. Antibiotikaresistenstester viste at isolasjon er svært følsom for alle testede antibiotika selv når lave konsentrasjoner ble brukt. I kontrast isolerer to er resistent mot alle antibiotika testet bortsett fra kloramfenikol og tetracyklin.

Mikroorganismen har trolig fått antibiotikaresistens på grunn av tilfeldige mutasjoner eller horisontal genoverføring som representerer en selektiv fordel under ekstreme miljøforhold. Denne studien viser nytten av slike metoder for å velge miljømikroorganisme som kan inaktivere miljøgiftene og konvertere dem til ufarlige produkter.