Biology
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使用脉冲幅度调制叶绿素荧光法对作物中的非光化学猝灭进行高通量分析
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该协议引入了一种高通量方法，用于通过脉冲幅度调制的叶绿素荧光测定法测量非光化学淬灭的松弛。该方法适用于田间生长的 甘氨酸max ，并且可以适应其他物种以筛选遗传多样性或繁殖种群。
Transcript
该方法可以深入了解遗传多样性面板或育种群体中可用的非光化学淬火的遗传变异。该技术的主要优点是有可能在一天内筛选出大量基因型在非光化学淬灭中的变异。该协议针对甘氨酸max或大豆提出，但可以调整为分析可以从中收集升降盘的其他植物空间。
对于第一次执行该协议的人来说，关键是处理提升盘以防止损坏或用水过度饱和海绵。首先，在发芽后30天在野外对植物进行取样。在24孔板的所有孔中填充1/3水平的蒸馏水。
在盖子和板的侧面标记要取样的重复。将最年轻的全膨胀叶子放在植物的顶部，放在橡胶塞上。将两号洪堡软木螟穿过叶子并扭转以切割圆盘，避开中间肋骨。
从同一片叶子中连续收集五个圆盘进行技术复制。使用棉签将叶盘从软木螟中挤出到24孔板的单孔中，并对相同基因型的不同植物重复此操作。检查所有叶盘是否漂浮在水中。
如果没有，用棉签轻轻地将粘在井边的叶盘移动到漂浮的位置。继续从下图中取样光盘。盖上盖子，用半透明的柔性薄膜密封。
在整个24孔板中完成采样后。将盘子存放在袋子、盒子或空冷却器中，避免阳光直射。在干净的实验室空间中，轻敲密封板的盖子，以在运输过程中将粘在盖子上的叶盘移开。
打开薄膜并取下盖子。将叶盘从24孔板的第一个位置转移到新鲜的96孔板中，叶盘朝向孔底部的平直下方。将鼻吸器过滤器切成两半。
将得到的过滤器浸入水中一半，然后轻拍纸巾以除去多余的液体。用叶盘将过滤器插入孔中以保持湿度。从24孔板的第一个位置取第二个叶盘，并将其面朝下放置在96孔板的下一个可用位置。
将鼻腔过滤器的剩余一半浸入水中，将其轻拍在纸巾上，然后将其与第二个叶盘一起插入孔中。用胶带粘住右上角，以帮助在黑暗中定位板以进行成像。用半透明的柔性薄膜密封板，并用铝箔包裹板。
在铝箔上写下绘图ID和板ID。将板放在黑暗的盒子或橱柜中至少30分钟，以放松非光化学淬火的前两个阶段。如果对非光化学淬灭的长期阶段感兴趣，请在成像前使用一小时的长时间暗潜伏期。
通过在新鲜96孔板的每个角落放置一个叶盘并在中心放置一个叶盘，准备一个额外的假板，以便在分析过程中聚焦。像以前的板一样用鼻过滤器固定叶盘，密封板，并在室温和50%相对湿度的黑暗中孵育。打开成像仪并打开成像软件。
单击“设置”，然后单击“协议”以打开一个窗口，用于在 PAM 实验协议中输入步骤。设置手稿中提供的机器的技术规格。将程序设置为从饱和脉冲开始，通过在名为“延迟之后”的框中输入20秒来测量暗适应光合作用的最大量子效率。
单击“应用脉冲”框，然后在标题为“此次数”的框中输入 1。将脉冲 PPFD 设置为 6， 152，将脉冲长度设置为 800 毫秒，并选中“使用所有脉冲拍摄 F 素数和 FM 素数图像”框。选中“插入后”以向协议添加第二个步骤。
在标题为“延迟之后”的框中输入 30 秒。然后，选择选项“更改光化”，并在标题为“光化 PPFD”的框中输入 50，将腔室的光强度设置为 50 PPFD。单击“插入时间后”向协议添加新步骤，并在标题为“延迟之后”的框中输入 150 秒。
选择“应用脉冲”，然后在标题为“此次数”的框中输入 4，以便在光化光保持在 50 PPFD 时连续四次应用测量脉冲。根据手稿中提供的值调整每个步骤的延迟和光强度，然后将实验方案另存为所需位置的pcl文件。关闭灯并将假板面朝下放在样品台上，使叶子的轴表面朝上指向探测器，海绵朝下朝向平台。
设置样品台高度，使叶盘高于仪器底座140毫米。单击连接/断开连接至成像仪相机和硬件相机图标以启动相机。单击焦点荧光符号（由底部的红色双面箭头图标和两条绿线表示），然后调整透镜和曝光以使板对焦。
再次单击焦点荧光图标以关闭闪烁的指示灯。在黑暗中工作，用要分析的板替换假板。将其面朝下放置，外部用于定向右上角的胶带，然后单击地图图像相机图标。
通过打开或关闭光圈来调整图像曝光，直到弹出窗口中的条形位于绿色区域中。每次调整光圈后，单击“重试”按钮，直到正确调整曝光并拍摄图像。右键单击图像，然后选择应用图像隔离以阻止背景信号。
聚焦的叶区域将以灰色显示，背景以蓝色显示。通过右键单击图像，从修改图像下拉菜单中调整直方图和伽马水平，选择感兴趣的区域或像素以仅包含叶盘。右键单击图像，然后选择删除高切口和低切口以删除浅蓝色的高亮区域。
右键单击图像，然后选择“删除杂散”以删除不接触最后三个其他像素的任何像素。影像上显示为孤立岛屿的任何区域都将单独进行分析，并包含在最终数据输出中。单击运行协议图标以启动程序。
屏幕底部将出现一个计时器，通知您协议还剩下多长时间。等到协议完成。单击文件并另存为，将数据另存为 igr 文件。
在启动另一个样品板之前，单击窗口右上角的红叉关闭窗口。要导出叶绿素荧光数据，请在成像软件中打开igr文件，然后单击“文件”，然后单击“导出到文件夹”以创建一个包含所有必要文件的新文件夹。对田间大豆非光化学猝灭的典型测量表明，当叶盘暴露于每秒50微摩尔的低光下时，在初始饱和闪光以确定Fv / Fm之后，非光化学淬火小于1。
此外，在转移到每秒2， 000微摩尔的高光下时，非光化学淬火在15分钟后增加到最大值4。失败的测量显示，在转移到高光下时，非光化学淬火的增加很小。成像仪内的定位板以及明确定义的叶盘采样和电镀计划对于确保数据链接到正确的基因型至关重要。
该协议可以量化环境变量（如干旱和脱落）对非光化学淬火的影响，或评估不同冠层水平的非光化学淬火，以完善作物模型。
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生物学，第185期，Related Videos
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