Chemistry
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
有机溶剂基蛋白质沉淀，在质谱分析之前实现强大的蛋白质组纯化
Chapters
Summary February 7th, 2022
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
本方案描述了在受控条件下的溶剂型蛋白质沉淀，以便在质谱分析之前稳定快速地回收和纯化蛋白质组样品。
Transcript
这些方案旨在通过溶剂型沉淀最大限度地提高蛋白质的回收率和纯度。我们将向您展示一些在小瓶中进行沉淀的技巧，以及离心柱形式的半自动方法。我们还优化了降水方案，使其一致且快速。
整个协议只需几分钟。这些方案表明，蛋白质的溶剂沉淀是质谱之前样品制备的理想选择。这些协议将无缝融入自下而上以及自上而下的专业工作流程。
今天将为我们展示的是Ziheng Dang和新斯科舍省哈利法克斯Proteoform Scientific的高级科学家Victoria Miller，将90微升无颗粒蛋白质溶液移液到聚丙烯微量离心管中。然后在样品溶液中加入10微升一摩尔氯化钠水溶液和400微升丙酮，盖上盖子并轻轻敲击小瓶以混合溶剂。让小瓶孵育它。
室温不受干扰孵育后至少两分钟，离心样品注意小瓶的方向，并在室温下以10， 000 RCF或更高的速度旋转至少两分钟。离心后，在管底部观察到可见的白色沉淀。此时，打开管子的盖子，并通过倒置管子将上层物倒入废物容器中。
使用纸巾从小瓶中抽出任何残留溶剂。对于包含样品的 SDS。小心地分配400微升新鲜丙酮，不要干扰颗粒。
通过将小瓶以与初始旋转相同的方向放入转子中，立即在室温下以 10， 000 倍 G 或更高的温度将样品中心化一分钟。如前所述计算洗涤溶剂。打开盖子干燥样品约一分钟。
在通风橱中，在颗粒溶解之前。将100微升蛋白质溶液分配到聚丙烯小瓶中。在通风橱中，加入400微升甲醇，然后加入100微升氯仿。
盖上小瓶盖并短暂涡旋以混合。快速将300微升水直接分配到小瓶的中心。盖上小瓶，让它在工作台上不受干扰地放置一分钟，然后将聚丙烯小瓶放入离心机中，并在室温下以 10， 000 倍 G 或更高的速度旋转五分钟。
观察到小瓶具有两个溶剂层和一个可见的白色颗粒，直到小瓶处于大约45度。首先使用大的1毫升微量移液器吸头以均匀的速率从上层除去约700微升溶剂，然后使用200微升移液器吸头，直到它在小瓶中形成珠子。通过将溶剂分配到样品瓶侧面，在不干扰沉淀的情况下向样品瓶中加入 400 微升新鲜甲醇。
盖上小瓶的盖子，并通过轻轻摇动小瓶将溶剂旋转在一起来合并溶剂层。观察白色蛋白质沉淀，注意小瓶在转子离心机中的方向，在室温下以10， 000倍G或更高。使小瓶倾斜，使颗粒朝下。
将移液器吸头沿小瓶的上边缘放置，并用一毫升微量移液器吸头以缓慢但均匀的速率除去上清液。保留约20微升溶剂。让残留溶剂在通风橱中干燥。
沉淀蛋白质。使用一次性滤芯将塞子连接到上部滤芯。混合90微升蛋白质溶液10微升一摩尔水，氯化钠和400微升丙酮。
在工作台上孵育至少两分钟，将制备好的蛋白质样品，塞子仍然连接到过滤柱上，在室温 G.At 2， 500 倍下离心两分钟，倒置滤芯并从滤芯底座上拧下并取下塞子。将过滤柱放入干净的小瓶中，在室温下以500倍G离心蛋白质样品三分钟。丢弃来自下小瓶的溶剂。
通过向过滤柱中加入400微升丙酮来洗涤蛋白质沉淀，在室温下以500倍G离心三分钟，或直到上部滤芯中没有溶剂残留。遵循先前演示的蛋白质沉淀方案。通过在过滤滤芯底部润湿膜来重新溶解蛋白质，方法是将 2 到 5 微升的 ISO 丙醇直接分配到膜上，然后立即进行再溶解方案以重新溶解蛋白质沉淀制备 80% 体积的甲酸在水中的溶液。
在零下20摄氏度下预冷该酸溶液，并在含有沉淀蛋白质的过滤滤芯中预冷。将 50 微升冷稀释甲酸分配到冷却的墨盒盖中并涡旋 30 秒。将滤芯在零下 20 摄氏度下放回冰箱 10 分钟。
重复前面的涡旋和孵育步骤。加入450微升水，最终体积为500微升。将甲酸稀释至8%倒置卡式瓶，拧下并从卡式瓶底座上取下塞子，然后将SPE卡式瓶连接到小瓶上。
在室温下以800倍G离心通过SPE滤芯旋转蛋白质5分钟.如果溶剂残留在上部滤芯中，则将滤芯返回离心机并重复离心。通过向SPE柱中加入300微升5%乙腈和0.1%TFA水溶液冲洗，以2000倍G流过SPE柱两分钟.对于低分子量蛋白质或消化肽，通过流动300微升洗脱样品。50%乙腈与0.1%的TFA在2， 500倍G下持续5分钟。
使用300微升75%乙腈和0.1%三氟苦行酸进行额外的躲避步骤。合并两个生成的提取物。该图比较了一次性滤芯中基于小瓶或沉淀蛋白质后的SDS耗竭。
使用丙酮与传统的快速和CMW方案。所有方法都可以降低SDS，以实现最佳的质谱分析。该图显示了通过对加工酵母全细胞裂解物进行SDS页面分析的快速丙酮沉淀和CMW沉淀的定量蛋白质回收率。
所有沉淀方案均获得一致的回收率。在一次性滤芯中进行沉淀，无需小心移液含有上清液的SDS，同时将聚集的蛋白质保留在膜过滤器上方。因此，在三个独立重复的上清液级分中没有检测到可见条带。
与基于小瓶的沉淀相比，基于柱的蛋白质沉淀显示出胃蛋白酶消化的牛血浆样品的回收率更高。当使用氯化钠时，在滤芯中观察到更显着的产量差异，而使用锌溶剂导致最高产量。该图量化了每个肽样品的肽峰强度，其比率高于1，反映了在一次性滤芯中处理的样品的肽丰度更高。
该图比较了三种重复样品制备中每种蛋白质的鉴定肽数。这些图表中的相关系数为0.94至0.95，证明了自下而上质谱分析的样品制备方法的高度一致性。因此，一旦颗粒形成，您真的要避免干扰它。
如果您将其保留为完整的颗粒，您将获得更高的产量。因此，请确保不要忘记用额外的丙酮清洗该颗粒。这确保了我们摆脱了SDS，使我们的样品尽可能干净，这为我们提供了最佳的质谱分析。
因此，我们发现通过倒置来去除多余的溶剂比尝试移液样品要简单得多。通过这种方式，您将获得更稳定的产量。在室温下进行丙酮沉淀比在冰箱中进行传统沉淀更一致、更快速的回收。
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
