Login processing...

Journal / Chemistry /

JoVE Journal
Chemistry

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.

JoVE Journal Chemistry

Organisk lösningsmedelsbaserad proteinutfällning för robust proteomrening före masspektrometri

Synthesis of pH Dependent Pyrazole, Imidazole, and Isoindolone Dipyrrinone Fluorophores using a Claisen-Schmidt Condensation Approach

Journal (Chemistry)

Synthesis of pH Dependent Pyrazole, Imidazole, and Isoindolone Dipyrrinone Fluorophores using a Claisen-Schmidt Condensation Approach

Synthesis of Aptamer-PEI-g-PEG Modified Gold Nanoparticles Loaded with Doxorubicin for Targeted Drug Delivery

Journal (Chemistry)

Synthesis of Aptamer-PEI-g-PEG Modified Gold Nanoparticles Loaded with Doxorubicin for Targeted Drug Delivery

Click here for the English version

Organisk lösningsmedelsbaserad proteinutfällning för robust proteomrening före masspektrometri

Article DOI: 10.3791/63503-v • 11:12 min

February 7th, 2022 •

Jessica L. Nickerson¹, Venus Baghalabadi¹, Ziheng Dang¹, Victoria A. Miller², Sara L. Little², Alan A. Doucette¹

¹Department of Chemistry, Dalhousie University, ²Proteoform Scientific Inc.

Chapters

Summary
Automatic Translation

English (Original)
العربية (Arabic)
中文 (Chinese)
dansk (Danish)
Nederlands (Dutch)
français (French)
Deutsch (German)
עברית (Hebrew)
हिंदी (Hindi)
italiano (Italian)
日本語 (Japanese)
한국어 (Korean)
norsk (Norwegian)
português (Portugese)
русский (Russian)
español (Spanish)
svenska (Swedish)
Türkçe (Turkish)

February 7th, 2022

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Detta protokoll beskriver lösningsmedelsbaserad proteinutfällning under kontrollerade förhållanden för robust och snabb återhämtning och rening av proteomprover före masspektrometri.

Transcript

Dessa protokoll är utformade för att maximera återhämtningen såväl som renheten hos proteiner genom lösningsmedelsbaserad utfällning. Vi kommer att visa dig ett par knep för att utföra nederbörd i injektionsflaskor, samt ett halvautomatiskt tillvägagångssätt i ett spinnpatronformat. Vi har också optimerat nederbördsprotokollet för att vara konsekvent och snabbt.

Hela protokollet tar bara några minuter. Dessa protokoll visar att lösningsmedelsutfällning av proteiner är idealisk för provförberedelse före masspektrometri. Protokollen passar sömlöst in i såväl underifrån och ner pro-arbetsflöden.

Demonstrerar för oss idag kommer att vara Ziheng Dang och Victoria Miller, Senior forskare vid Proteoform Scientific i Halifax, Nova Scotia Pipette 90 mikroliter partikelfri proteinlösning i ett polypropenmikrocentrifugrör. Tillsätt sedan 10 mikroliter vattenhaltig natriumklorid och 400 mikroliter aceton i provlösningen, täck och knacka försiktigt på injektionsflaskan för att kombinera lösningsmedlen. Låt injektionsflaskan inkubera den.

Rumstemperatur ostörd i minst två minuter efter inkubation, centrifugera proverna med angivande av injektionsflaskans orientering och snurra i minst två minuter vid 10 000 RCF eller högre vid rumstemperatur. Efter centrifugeringen observeras en synlig vit pellet i botten av röret. Vid denna tidpunkt, ta bort röret och dekantera supernatet i en avfallsbehållare genom att invertera röret.

Använd en pappershandduk för att dra eventuell kvarvarande vätska från injektionsflaskan. För SDS som innehåller prover. Fördela försiktigt 400 mikroliter färsk aceton utan att störa pelleten.

Centrera omedelbart provet i en minut vid 10 000 gånger G eller högre vid rumstemperatur genom att placera injektionsflaskan i rotorn i samma riktning som den ursprungliga snurrningen. Räkna bort tvättlösningsmedlet som beskrivits tidigare. Torka provet med locket öppet i ungefär en minut.

I en dragskåp, före en pelletslösning. Dispensera 100 mikroliter av proteinlösningen i en injektionsflaska med polypropen. I dragskåpet tillsätter du 400 mikroliter metanol följt av 100 mikroliter kloroform.

Täck injektionsflaskan och virveln kort för att blanda. Fördela snabbt 300 mikroliter vatten direkt i mitten av injektionsflaskan. Täck injektionsflaskan och låt den sitta ostört på bänkskivan i en minut, efter att injektionsflaskan av polypropen har placerats i en centrifug och snurrat den i fem minuter vid 10 000 gånger G eller högre vid rumstemperatur.

Injektionsflaskan observeras ha två lösningsmedelsskikt och en synlig vit pellet till injektionsflaskan vid cirka 45 grader. Ta bort cirka 700 mikroliter av lösningsmedlet från det övre lagret med en jämn hastighet med en stor en milliliters mikropipettspets initialt och senare med en 200 mikroliters pipettspets tills den bildar en pärla i injektionsflaskan. Tillsätt 400 mikroliter färsk metanol till provflaskan utan att störa pelleten genom att fördela vätskan längs flaskans sida.

Täck injektionsflaskan och kombinera lösningsmedelsskikten genom att försiktigt gunga injektionsflaskan för att virvla ihop lösningsmedlen. För att observera den vita proteinpelleten som noterar injektionsflaskans orientering i rotorcentrifugen i minst 10 minuter vid 10 000 gånger G eller högre vid rumstemperatur. Vinkla injektionsflaskan med pelleten nedåt.

Placera en pipettspets längs injektionsflaskans övre kant och ta bort supernatanten med en milliliters mikropipettspets med en långsam men enhetlig hastighet. Behåller cirka 20 mikroliter lösningsmedel. Låt det kvarvarande lösningsmedlet torka i dragskåpet.

Att fälla ut proteinet. Använd en engångsfiltreringspatron och fäst kontakten på den övre filtreringspatronen. Kombinera 90 mikroliter proteinlösning 10 mikroliter av en mol vatten, natriumklorid och 400 mikroliter aceton.

Inkubera i minst två minuter på bänkskivan, centrifugera det beredda proteinprovet med pluggen fortfarande fäst vid filtreringspatronen i två minuter vid 2 500 gånger G.At rumstemperatur, vänd patronen och skruva loss och ta bort kontakten från patronbasen. Placera filtreringspatronen i en ren injektionsflaska centrifugera proteinprovet i tre minuter vid 500 gånger G vid rumstemperatur. Kassera flödet genom vätska från den nedre injektionsflaskan.

Tvätta proteinpelleten genom att tillsätta 400 mikroliter aceton till filtreringspatronen, centrifugera i tre minuter vid 500 gånger G vid rumstemperatur eller tills inget lösningsmedel finns kvar i den övre patronen. Efter de tidigare demonstrerade proteinutfällningsprotokollen. Lös proteinet igen genom att väta membranet vid basen av filtreringspatronen genom att dispensera två till fem mikroliter ISO-propanol direkt till membranet omedelbart innan du fortsätter till återlösningsprotokollet för återlöslighet av proteinpelleten framställ 80% volymlösning av myrsyra i vatten.

Förkyl denna syralösning vid minus 20 grader Celsius och filtreringspatronen innehåller utfällt protein. Fördela 50 mikroliter kall utspädd myrsyra i det kylda patronlocket och virveln i 30 sekunder. Sätt tillbaka filtreringspatronen i frysen vid minus 20 grader Celsius i 10 minuter.

Upprepa föregående virvel- och inkubationssteg. Tillsätt 450 mikroliter vatten till en slutlig volym på 500 mikroliter. Späd myrsyran till 8% Invertera patronen skruva loss och ta bort kontakten från patronbasen och fäst SPE-patronen på injektionsflaskan.

Snurra proteinet genom SPE-patronen i en centrifug vid rumstemperatur i fem minuter vid 800 gånger G.Om lösningsmedel finns kvar i den övre patronen återför patronen till centrifugen och upprepa snurret. Skölj genom att tillsätta 300 mikroliter 5% acetonitril med 0,1% TFA i vatten till SPE-patronen, strömma genom SPE-patronen i två minuter vid 2000 gånger G.För proteiner med låg molekylvikt eller smälta peptider eluerar provet genom att strömma 300 mikroliter. En 50% acetonitril med 0,1% TFA i fem minuter vid 2 500 gånger G.För intakta proteiner.

Följ upp med ett ytterligare elusionssteg med 300 mikroliter 75% acetonitril med 0,1% Trifluorasketsyra. Kombinera de två resulterande extrakten. I figuren jämförs SDS-utarmningen efter injektionsflaska baserad eller utfällning av proteiner i en engångsfilterpatron.

Använda aceton med de konventionella snabb- och CMW-protokollen. Alla metoder minskar SDS för att möjliggöra optimal masspektrometrianalys. Denna figur visar kvantitativ proteinåtervinning genom att följa snabb acetonutfällning och CMW-utfällning genom SDS-sidanalys av en bearbetad jäst total celllysat.

Konsekvent återhämtning erhölls med alla nederbördsprotokoll. Utfällning i en engångsfiltreringspatron eliminerar behovet av att försiktigt pipettera SDS som innehåller supernatant samtidigt som de aggregerade proteinerna behålls ovanför ett membranfilter. Således detekterades inga synliga band i supernatantfraktionerna över tre oberoende replikat.

Den patronbaserade proteinutfällningen visar överlägsen återvinning av ett Pepsin-smält prov av bovin plasma i förhållande till injektionsflaskabaserad utfällning. Mer signifikanta skillnader i utbyte noteras i patronen vid användning av natriumklorid medan zinklösningsmedel används resulterade i det högsta utbytet. Denna siffra kvantifierar peptidens toppintensitet från varje peptidprov med ett förhållande över ett som återspeglar ett högre peptidöverflöd för prover som bearbetas i engångsfilterpatronerna.

Figuren jämför antalet identifierade peptider per protein över de tre replikatprovpreparaten. Korrelationskoefficienterna 0,94 till 0,95 i dessa grafer visar den höga konsistensen av provberedningsmetoden för masspektrometrianalys nedifrån och upp. Så när den pelleten har bildats vill du verkligen undvika att störa den.

Om du behåller den som en intakt pellets får du ett högre utbyte. Så se till att inte glömma att tvätta pelleten med extra aceton. Detta är att se till att vi blir av med SDS och håller vårt prov så rent som möjligt och det ger oss den bästa masspektrometrianalysen.

Så vi fann att det är mycket enklare att ta bort överflödigt lösningsmedel genom att invertera det än att försöka pipettera provet. Du får mer konsekventa avkastningar på detta sätt. Att utföra acetonutfällning vid rumstemperatur resulterade i en mer konsekvent och snabbare återhämtning än traditionell nederbörd i frysen.

X

Simple Hit Counter