Immunology and Infection
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
تحليل البيلة البروتينية ، والتسلل الكلوي للكريات البيضاء ، والترسب الكلوي للبروتينات في الفئران المعرضة للذئبة MRL / lpr
Chapters
Summary June 8th, 2022
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
يصف هذا البروتوكول طريقة لتتبع تطور مرض الذئبة في الفئران. يتم تقديم إجراءين إضافيين لتوصيف التهاب الكلية الذئبي بناء على تسلل الخلايا وترسب البروتين في الكلى.
Transcript
يمكن أن تساعد هذه الطرق في التحقيق في تطور الالتهاب المزمن المرتبط بالكلى لدى مرضى الذئبة. نحن نقدم بديلا موثوقا وفعالا من حيث التكلفة يمكن استخدامه لمراقبة مسار المرض في مرض الذئبة. ابدأ في تعقيم الغطاء عن طريق رش 70٪ من الإيثانول ووضع ورقة بلاستيكية معقمة على السطح.
ثم قم بإعداد نصائح وأنابيب 1.5 ملليلتر وماصة لجمع حوالي 20 ميكرولتر من البول. خذ القفص ورش 70٪ من الإيثانول قبل وضعه داخل الغطاء. بعد ذلك ، أمسك الماوس بيد واحدة واستخدم اليد الأخرى لتدليك المنطقة البطنية بلطف من الأعلى إلى الأسفل.
باستخدام أنبوب أو ماصة 1.5 ملليلتر ، اجمع البول مباشرة. أو إذا كانت قطرات العينة تجمعها من الغطاء البلاستيكي. ثم ضع الماوس مرة أخرى في القفص.
قطع الكلى تشريح إلى حجم الحبوب وهضمها في خمسة ملليلتر من الهضم العازلة التي تحتوي على الكولاجيناز و DNase 1 في RPMI 1640 المتوسطة التي تحتوي على HEPES لمدة ساعة واحدة مع اهتزاز لطيف مستمر عند 37 درجة مئوية. أضف 10 ملليلتر من PBS البارد المثلج الذي يحتوي على 10 ملليمولار من EDTA واحتضنه لمدة 10 دقائق على الثلج. ثم دوامة التعليق مرتين.
في وقت لاحق ، قم بتصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة 100 ميكرومتر واغسلها ب 10 ملليلتر من HBSS ممتلئة. بعد ذلك ، جهاز طرد مركزي في 350 مرة G لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بإعداد محلول Percoll متساوي التوتر بنسبة 30 و 37 و 70٪ وأضف طبقة من محلول Percoll بنسبة 37٪ فوق محلول 70٪.
إعادة تعليق الخلايا في خمسة ملليلتر من 30٪ مخزون متساوي التوتر Percoll. باستخدام ماصة باستور ، قم بتحميل 37٪ من خمسة ملليلتر في الأعلى و 70٪ من خمسة ملليلتر في الأسفل ، مما يجعل تدرج Percoll متساوي التوتر في المخزون. ثم ، جهاز طرد مركزي مع رقم أعلى تسعة ورقم صفر لأسفل عند 1000 مرة G لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
بعد ذلك ، قم بجمع الكريات البيض من الواجهة 37 إلى 70٪ وأعد تعليقها في خمسة ملليلتر من C 10. مرة أخرى ، جهاز طرد مركزي في 350 مرة G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. ثم أعد تعليق حبيبات الخلايا في ثلاثة ملليلترات من المخزن المؤقت للفاكس وأجهزة الطرد المركزي عند 350 مرة G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية.
ثم تخلص من supernatant تاركا حوالي 50 ميكرولتر من الحجم الكلي. أضف 50 ميكرولتر من كتلة مستقبلات FC لكل أنبوب. بعد هذا المزيج واحتضن على الثلج في الظلام لمدة 10 دقائق.
في وقت لاحق ، أضف ملليلتر من المخزن المؤقت للفاكس للغسيل. ثم ، جهاز الطرد المركزي في 350 مرة G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية والتخلص من supernatent ترك حوالي 50 ميكرولتر من الحجم الكلي. بعد ذلك ، أضف 20 ميكرولتر من صبغة الفلورسنت المناسبة واتركها تقف لمدة 15 إلى 30 دقيقة على الجليد.
أضف 50 ميكرولتر من مزيج الأجسام المضادة لكل أنبوب يحتوي على CD 138 البنفسجي اللامع سبعة 11 و CD 45 Alexa Fluor 700 واحتضنه على الثلج في الظلام لمدة 15 إلى 30 دقيقة. بعد ذلك، أضف ثلاثة ملليلترات من المخزن المؤقت للفاكس. جهاز طرد مركزي بسرعة 350 مرة G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية.
قم بإزالة supernatant عن طريق الفراغ تاركا حوالي 50 ميكرولتر من الحجم الكلي. في وقت لاحق ، أعد تعليق بيليه الخلية في 200 ميكرولتر من PBS. لجمع العينة ، قم بتضمين نصف الكلى في cryomold البلاستيكي الصغير مع مركب درجة حرارة القطع الأمثل.
ثم أضف الثلج الجاف إلى صندوق رغوة البوليسترين وضع المبرد بعناية فوق الثلج الجاف. بعد ذلك ، قم بإزالة قالب التبريد ، ولفه بورق الألومنيوم وتخزينه عند 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى الاستخدام مرة أخرى. ثم قم بإصلاح الأقسام الجافة إلى أربعة ميكرومتر باستخدام الأسيتون البارد لمدة 10 دقائق.
بعد تثبيت الشرائح ، تجف في الهواء لمدة 0.5 إلى ساعة واحدة وتخزنها عند 20 درجة مئوية تحت الصفر لفترة قصيرة أو ناقص 80 درجة مئوية لفترة طويلة. لتلطيخ العينات، أعد إصلاح الشرائح في الأسيتون البارد لمدة خمس إلى 10 دقائق واسمح للأقسام بالإحماء إلى درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، باستخدام قلم بات ، ارسم دائرة مسعورة حول القسم واتركه يجف.
ثم ضع الشرائح في TBS في جرة كوبلاند لمدة 20 دقيقة ورجها بلطف عن طريق وضع الجرة على الخلاط. في وقت لاحق ، صب TBS وملء الجرة مع TBS 5 ٪ BSA و 0.1 ٪ TW 20. في وقت لاحق ، احتضن الجرة لمدة 20 دقيقة عن طريق الاهتزاز بلطف على الخلاط.
ثم أخرج الشرائح وامسح الجزء السفلي من الشرائح. أضف 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة المترافقة C3 تناسب C و IgG2 APE إلى القسم واحتضن درجة حرارة الغرفة في غرفة رطبة لمدة ساعة واحدة. اغسل القسم ثلاث مرات في PBS 5٪ BSA و 0.1٪ TW 20 لمدة 10 دقائق على الخلاط ثم رج الشرائح جافة.
قم بتركيب القسم باستخدام كاشف مضاد للتلاشي ثم باستخدام قسيمة غطاء. ثم قم بتخزين الشرائح عند أربع درجات مئوية حتى يتم عرضها تحت المجهر. لتحليل الصور باستخدام برنامج الصورة J ، حدد المنطقة المطلوبة.
بعد ذلك ، قم بتعيين المعلمات القياسية بالنقر فوق تحليل ثم تعيين القياسات وقياس المنطقة للحصول على النتائج. بعد ذلك ، انقل البيانات التي تم الحصول عليها من نوافذ القياس إلى جدول بيانات. بمجرد الانتهاء من ذلك ، انقر فوق تحليل لقياس المنطقة ونقل البيانات مرة أخرى إلى جدول البيانات السابق.
تم الكشف عن مستويات البروتين في بول الفئران MRL LPR مع مرور الوقت حيث عولجوا بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات كمجموعة تحكم و lactobacillus reuteri كمجموعة علاجية. عالجت مجموعة الفئران مع L.reuteri في تطور بروتينية أكثر عدوانية من المجموعة الضابطة. تم إجراء تحليل الفاكس لكريات الدم البيضاء المعزولة لتحليل خلايا البلازما.
علاوة على ذلك ، عولجت الفئران بالفانكومايسين أو الفانكومايسين جنبا إلى جنب مع الحمض النووي المزدوج للإشريكية القولونية. على الرغم من أنه كان من المتوقع أن يؤدي الحمض النووي الإشريكية القولونية المزدوجة إلى التسلل الكلوي ، إلا أنه لم يتم العثور على فرق كبير في النسبة المئوية لخلايا البلازما. تم الكشف عن المكمل C3 و IgG2a من خلال تلطيخ التألق المناعي على أقسام الكلى MRL IPR للإناث.
تمت مقارنة العوامل البيئية الفعالة على الترسيب الكلوي ل C3 و IgG2a لخبز الفئران الداخلي في منشأة الحيوانات وتلك التي تم شراؤها من بائع. لم يظهر التحليل الكيميائي النسيجي المناعي أي فرق بين المجموعتين. يمكن أن تكون إضافة كل طبقة من النسبة المئوية للمخزون ISO 20 Percoll الحل تحديا ، وإذا اختلطت ، فعليك البدء من جديد.
يساعد هذا الإجراء في قياس التدفق الخلوي وتجارب فيتر ، لذلك لا يمكنك دراسة نوع خلايا الكلى المختلفة للسكان. يسمح لنا هذا الإجراء بدراسة الخلايا البائية التي تتسلل إلى الكلى وليس هناك الكثير من المعلومات في الأدبيات.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
