Immunology and Infection
A subscription to JoVE is required to view this content.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Analyses van proteïnurie, renale infiltratie van leukocyten en renale afzetting van eiwitten bij lupusgevoelige MRL / lpr-muizen
Chapters
Summary
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Het huidige protocol beschrijft een methode om lupusprogressie bij muizen te volgen. Twee aanvullende procedures worden gepresenteerd om lupus nefritis te karakteriseren op basis van celinfiltratie en eiwitafzetting in de nieren.
Transcript
Deze methoden kunnen helpen bij het onderzoeken van de progressie van chronische ontsteking geassocieerd met nieren bij lupuspatiënten. We bieden een betrouwbaar en kosteneffectief alternatief dat kan worden gebruikt om het ziekteverloop bij lupus te volgen. Begin met het steriliseren van de kap door 70% ethanol te spuiten en plaats een steriele plastic plaat op het oppervlak.
Bereid vervolgens tips, buisjes van 1,5 milliliter en een pipet voor om ongeveer 20 microliter van de urine te verzamelen. Neem de kooi en spuit 70% ethanol voordat u deze in de kap plaatst. Houd daarna de muis met één hand vast en gebruik de andere hand om het ventrale gebied van boven naar beneden zachtjes te masseren.
Gebruik een buis of pipet van 1,5 milliliter om de urine direct op te vangen. Of als de monsterdruppels het van het plastic vel verzamelen. Zet de muis vervolgens terug in de kooi.
Snijd de ontleedde nieren in korrelgrootte en verteer in vijf milliliter digestiebuffer met Collagenase en DNase 1 in RPMI 1640 medium met HEPES gedurende één uur met continu zacht schudden bij 37 graden Celsius. Voeg 10 milliliter ijskoude PBS met 10 millimol EDTA toe en incubeer gedurende 10 minuten op ijs. Vervolgens vortex de suspensie twee keer.
Filter later de celsuspensie door een zeef van 100 micrometer en was met 10 milliliter HBSS vol. Centrifugeer daarna op 350 maal G gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Bereid een 30, 37 en 70% stock isotone Percoll oplossing en voeg een laag van 37% Percoll oplossing toe aan de 70% oplossing.
Resuspensie de cellen in vijf milliliter van 30% voorraad isotone Percoll. Gebruik een Pasteur-pipet om langzaam 37% van vijf milliliter boven en 70% van vijf milliliter aan de onderkant te laden, waardoor stock isotone Percoll-gradiënt ontstaat. Centrifugeer vervolgens met nummer negen omhoog en nummer nul omlaag op 1000 keer G gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
Verzamel daarna leukocyten uit de interface van 37 tot 70% en suspensie ze opnieuw in vijf milliliter C 10. Nogmaals, centrifugeer op 350 maal G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Vervolgens wordt de celpellet opnieuw gesuspendeerd in drie milliliter faxbuffer en gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius gecentrifugeerd bij 350 maal G.
Gooi vervolgens het supernatant weg en laat ongeveer 50 microliter van het totale volume achter. Voeg 50 microliter FC-receptorblok per buis toe. Volg deze mix en incubeer op ijs in het donker gedurende 10 minuten.
Voeg later twee milliliter faxbuffer toe om te wassen. Centrifugeer vervolgens op 350 maal G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius en gooi de supernatent weg en laat ongeveer 50 microliter van het totale volume over. Voeg vervolgens 20 microliter van de juiste fluorescerende kleurstof toe en laat het 15 tot 30 minuten op ijs staan.
Voeg 50 microliter antilichaammix toe per buis met CD 138 briljant violet zeven 11 en CD 45 Alexa Fluor 700 en incubeer op ijs in het donker gedurende 15 tot 30 minuten. Voeg daarna drie milliliter faxbuffer toe. Centrifugeer op 350 maal G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius.
Verwijder het supernatant door ongeveer 50 microliter van het totale volume vacuüm achter te laten. Later wordt de celpellet opnieuw gesuspendeerd in 200 microliter PBS. Om het monster te verzamelen, integreert u de halve nier in de kleine plastic cryomold met de optimale snijtemperatuurverbinding.
Voeg vervolgens droogijs toe in een piepschuimdoos en plaats de cryomold voorzichtig bovenop het droogijs. Verwijder vervolgens de cryomold, wikkel deze in aluminiumfolie en bewaar deze bij min 80 graden Celsius tot verder gebruik. Bevestig vervolgens de droge tot vier micrometer secties met koude aceton gedurende 10 minuten.
Na het bevestigen van de dia's, aan de lucht drogen gedurende 0,5 tot een uur en bewaar ze op min 20 graden Celsius voor een korte tijd of min 80 graden Celsius voor een lange tijd. Om de monsters te kleuren, bevestigt u de dia's gedurende vijf tot 10 minuten opnieuw in koude aceton en laat u de secties opwarmen tot kamertemperatuur. Teken daarna met een dep een hydrofobe cirkel rond de sectie en laat deze drogen.
Plaats vervolgens 20 minuten dia's in TBS in de Copeland-pot en schud zachtjes door de pot op de shaker te zetten. Giet vervolgens TBS af en vul de pot met TBS 5%BSA en 0,1%TW 20. Incubeer de pot later gedurende 20 minuten door zachtjes op de shaker te schudden.
Haal vervolgens de dia's eruit en veeg de onderkant van de dia's schoon. Voeg 100 microliter geconjugeerde antilichamen C3 fit C en IgG2 APE toe aan de sectie en incubeer de kamertemperatuur in een bevochtigde kamer gedurende een uur. Was de sectie driemaal in PBS 5%BSA en 0,1%TW 20 gedurende 10 minuten op de shaker en schud vervolgens de dia's droog.
Monteer de sectie met een anti-fade reagens en vervolgens met een afdekslip. Bewaar de dia's vervolgens op vier graden Celsius totdat ze onder de microscoop worden bekeken. Voor beeldanalyse met behulp van de image J-software, schetst u het gewenste gebied.
Stel daarna standaardparameters in door op analyseren te klikken en stel vervolgens metingen in en meet het gebied om de resultaten te krijgen. Breng vervolgens de gegevens die zijn verkregen uit de metingsvensters over naar een spreadsheet. Als u klaar bent, klikt u op analyseren om de regio te meten en de gegevens opnieuw over te zetten naar de vorige spreadsheet.
De eiwitniveaus in de urine van MRL LPR-muizen werden in de loop van de tijd gedetecteerd, waar ze werden behandeld met fosfaat gebufferde zoutoplossing als de controlegroep en lactobacillus reuteri als de behandelingsgroep. De muizengroep behandeld met L.reuteri met een agressievere proteïnurieprogressie dan de controlegroep. De faxanalyse werd uitgevoerd voor de geïsoleerde nierleukocyten om de plasmacellen te analyseren.
Verder werden de muizen behandeld met vancomycine of vancomycine samen met Escherichia coli dubbelstrengs DNA. Hoewel Escherichia coli dubbelstrengs DNA naar verwachting de nierinfiltratie zou veroorzaken, werd er geen significant verschil gevonden in het percentage plasmacellen. Het complement C3 en IgG2a werden gedetecteerd door immunofluorescentiekleuring op vrouwelijke MRL IPR-niersecties.
De effectieve omgevingsfactoren op de renale afzetting van C3 en IgG2a werden vergeleken voor het eigen muizenbrood in de dierenfaciliteit en die gekocht bij een leverancier. De immunohistochemische analyse toonde geen verschil tussen de twee groepen. Het toevoegen van elke laag van de iso 20 percoll-oplossing kan een uitdaging zijn, en als ze zich mengen, moet je opnieuw beginnen.
Deze procedure helpt bij de flowcytometer en bij vitterexperimenten, dus je kunt de verschillende nierceltype populaties niet bestuderen. Deze procedure stelt ons in staat om de B-cellen infiltreert in de nieren te bestuderen en er is niet veel informatie in de literatuur.
Tags
Immunologie en infectie SLE lupus nefritis nier nierinfiltratie disfunctionele B-cellen eiwitdepositieRelated Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
