Immunology and Infection
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
प्रोटीनुरिया का विश्लेषण, ल्यूकोसाइट्स की गुर्दे की घुसपैठ, और ल्यूपस-प्रवण एमआरएल / एलपीआर चूहों में प्रोटीन का गुर्दे का जमाव
Chapters
Summary June 8th, 2022
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
वर्तमान प्रोटोकॉल चूहों में ल्यूपस प्रगति को ट्रैक करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है। गुर्दे में कोशिका घुसपैठ और प्रोटीन जमाव के आधार पर ल्यूपस नेफ्राइटिस को चिह्नित करने के लिए दो अतिरिक्त प्रक्रियाएं प्रस्तुत की जाती हैं।
Transcript
ये विधियां ल्यूपस रोगियों में गुर्दे से जुड़ी पुरानी सूजन की प्रगति की जांच करने में मदद कर सकती हैं। हम एक विश्वसनीय और लागत प्रभावी विकल्प प्रदान कर रहे हैं जिसका उपयोग ल्यूपस में रोग पाठ्यक्रम की निगरानी के लिए किया जा सकता है। 70% इथेनॉल छिड़काव करके हुड को निष्फल करना शुरू करें और सतह पर एक बाँझ प्लास्टिक शीट रखें।
फिर मूत्र के लगभग 20 माइक्रोलीटर इकट्ठा करने के लिए युक्तियाँ, 1.5 मिलीलीटर ट्यूब और एक पिपेट तैयार करें। पिंजरे को लें और हुड के अंदर रखने से पहले 70% इथेनॉल स्प्रे करें। बाद में, एक हाथ से माउस पकड़ो और धीरे से ऊपर से नीचे तक उदर क्षेत्र की मालिश करने के लिए दूसरे हाथ का उपयोग करें।
एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब या पिपेट का उपयोग करके, सीधे मूत्र इकट्ठा करें। या यदि नमूना बूंदें इसे प्लास्टिक शीट से इकट्ठा करती हैं। फिर माउस को पिंजरे में वापस रख दें।
विच्छेदित गुर्दे को अनाज के आकार में काटें और 37 डिग्री सेल्सियस पर निरंतर कोमल झटकों के साथ एक घंटे के लिए आरपीएमआई 1640 माध्यम में कोलेजनेज और डीएनएएसई 1 युक्त पाचन बफर के पांच मिलीलीटर में पचाएं। ईडीटीए के 10 मिलीमोलर युक्त बर्फ ठंडा पीबीएस के 10 मिलीलीटर जोड़ें और बर्फ पर 10 मिनट के लिए सेते हैं। फिर निलंबन को दो बार भंवर करें।
बाद में, 100 माइक्रोमीटर छलनी के माध्यम से सेल निलंबन को फ़िल्टर करें और एचबीएसएस पूर्ण के 10 मिलीलीटर के साथ धो लें। बाद में, कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 350 गुना जी पर अपकेंद्रित्र। एक 30, 37 और 70% स्टॉक आइसोटोनिक परकोल समाधान तैयार करें और 70% समाधान के शीर्ष पर 37% परकोल समाधान की एक परत जोड़ें।
30% स्टॉक आइसोटोनिक परकोल के पांच मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। पाश्चर पिपेट का उपयोग करके धीरे-धीरे पांच मिलीलीटर शीर्ष के 37% और तल पर पांच मिलीलीटर का 70% लोड करें, जिससे स्टॉक आइसोटोनिक परकोल ढाल बन जाता है। फिर, कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 1000 गुना जी पर नौ नंबर और नीचे संख्या शून्य के साथ अपकेंद्रित्र।
बाद में, 37 से 70% इंटरफ़ेस से ल्यूकोसाइट्स एकत्र करें और उन्हें सी 10 के पांच मिलीलीटर में फिर से निलंबित करें। फिर, चार डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 350 गुना जी पर अपकेंद्रित्र। इसके बाद चार डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए 350 गुना जी पर फैक्स बफर और अपकेंद्रित्र के तीन मिलीलीटर में सेल गोली को फिर से निलंबित करें।
फिर कुल मात्रा के लगभग 50 माइक्रोलीटर छोड़कर सतह पर तैरनेवाला को त्याग दें। प्रति ट्यूब एफसी रिसेप्टर ब्लॉक के 50 माइक्रोलीटर जोड़ें। इस मिश्रण के बाद और 10 मिनट के लिए अंधेरे में बर्फ पर सेते हैं।
बाद में, धोने के लिए फैक्स बफर के दो मिलीलीटर जोड़ें। फिर, चार डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए 350 गुना जी पर अपकेंद्रित्र और कुल मात्रा के लगभग 50 माइक्रोलीटर छोड़कर सतह पर तैरनेवाला त्यागें। अगला, उपयुक्त फ्लोरोसेंट डाई के 20 माइक्रोलीटर जोड़ें और इसे बर्फ पर 15 से 30 मिनट तक खड़े रहने दें।
सीडी 138 शानदार वायलेट सात 11 और सीडी 45 एलेक्सा फ्लोर 700 युक्त ट्यूब प्रति एंटीबॉडी मिश्रण के 50 माइक्रोलीटर जोड़ें और 15 से 30 मिनट के लिए अंधेरे में बर्फ पर सेते हैं। इसके बाद, फैक्स बफर के तीन मिलीलीटर जोड़ें। चार डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए 350 गुना जी पर अपकेंद्रित्र।
कुल मात्रा के लगभग 50 माइक्रोलीटर छोड़कर वैक्यूम द्वारा सतह पर तैरनेवाला निकालें। बाद में, पीबीएस के 200 माइक्रोलीटर में सेल गोली को फिर से निलंबित करें। नमूना इकट्ठा करने के लिए इष्टतम काटने के तापमान यौगिक के साथ छोटे प्लास्टिक क्रायोमोल्ड में आधा गुर्दे एम्बेड करें।
फिर एक पॉलीस्टाइनिन फोम बॉक्स में सूखी बर्फ जोड़ें और ध्यान से सूखे बर्फ के शीर्ष पर क्रायोमोल्ड रखें। इसके बाद, क्रायोमोल्ड को हटा दें, इसे एल्यूमीनियम पन्नी में लपेटें और इसे आगे के उपयोग तक शून्य से 80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। फिर 10 मिनट के लिए ठंडे एसीटोन के साथ सूखे से चार माइक्रोमीटर वर्गों को ठीक करें।
स्लाइड को ठीक करने के बाद, हवा 0.5 से एक घंटे के लिए सूख जाती है और उन्हें थोड़े समय के लिए शून्य से 20 डिग्री सेल्सियस या लंबे समय तक शून्य से 80 डिग्री सेल्सियस नीचे स्टोर करें। नमूनों को दागने के लिए, पांच से 10 मिनट के लिए ठंडे एसीटोन में स्लाइड को फिर से मिलाएं और वर्गों को कमरे के तापमान तक गर्म करने की अनुमति दें। बाद में, एक पैट पेन का उपयोग करके, अनुभाग के चारों ओर एक हाइड्रोफोबिक सर्कल खींचें और इसे सूखने दें।
फिर 20 मिनट के लिए कोपलैंड जार में टीबीएस में स्लाइड रखें और शेकर पर जार डालकर धीरे से हिलाएं। इसके बाद, टीबीएस डालें और जार को टीबीएस 5% बीएसए और 0.1% टीडब्ल्यू 20 के साथ भरें। बाद में, शेकर पर धीरे-धीरे हिलाकर 20 मिनट के लिए जार सेते हैं।
फिर, स्लाइड्स को बाहर निकालें और स्लाइड्स के निचले भाग को मिटा दें। अनुभाग में संयुग्मित एंटीबॉडी सी 3 फिट सी और आईजीजी 2 एपीई के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें और एक घंटे के लिए आर्द्र कक्ष में कमरे के तापमान सेते हैं। शेकर पर 10 मिनट के लिए पीबीएस 5% बीएसए और 0.1% टीडब्ल्यू 20 में अनुभाग को तीन बार धोएं और फिर स्लाइड को सूखा दें।
एक विरोधी फीका अभिकर्मक के साथ अनुभाग माउंट और फिर एक कवर पर्ची के साथ। फिर माइक्रोस्कोप के नीचे देखने तक स्लाइड्स को चार डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। छवि जे सॉफ्टवेयर का उपयोग करके छवि विश्लेषण के लिए, वांछित क्षेत्र की रूपरेखा तैयार करें।
इसके बाद, विश्लेषण पर क्लिक करके मानक पैरामीटर सेट करें, फिर परिणाम प्राप्त करने के लिए माप और माप क्षेत्र सेट करें। अगला, माप खिड़कियों से प्राप्त डेटा को स्प्रेडशीट में स्थानांतरित करें। एक बार हो जाने के बाद, क्षेत्र को मापने के लिए विश्लेषण पर क्लिक करें और डेटा को फिर से पिछले स्प्रेडशीट में स्थानांतरित करें।
एमआरएल एलपीआर चूहों के मूत्र में प्रोटीन के स्तर का समय के साथ पता चला जहां उन्हें नियंत्रण समूह के रूप में फॉस्फेट बफर खारा और उपचार समूह के रूप में लैक्टोबैसिलस के साथ इलाज किया गया था। चूहों के समूह ने नियंत्रण समूह की तुलना में अधिक आक्रामक प्रोटीनुरिया प्रगति पर एल.रॉयटरी के साथ इलाज किया। प्लाज्मा कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए पृथक गुर्दे ल्यूकोसाइट्स के लिए फैक्स विश्लेषण किया गया था।
इसके अलावा, चूहों को एस्चेरिचिया कोलाई डबल फंसे डीएनए के साथ वैनकोमाइसिन या वैनकोमाइसिन के साथ इलाज किया गया था। यद्यपि एस्चेरिचिया कोलाई डबल फंसे डीएनए को गुर्दे की घुसपैठ को ट्रिगर करने की उम्मीद थी, प्लाज्मा कोशिकाओं के प्रतिशत में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं पाया गया था। पूरक सी 3 और आईजीजी 2 ए महिला एमआरएल आईपीआर गुर्दे वर्गों पर इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला होने के माध्यम से पता लगाया गया था।
सी 3 और आईजीजी 2 ए के गुर्दे के जमाव पर प्रभावी पर्यावरणीय कारकों की तुलना पशु सुविधा में इन-हाउस चूहों की रोटी और विक्रेता से खरीदे गए लोगों के लिए की गई थी। इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विश्लेषण ने दोनों समूहों के बीच कोई अंतर नहीं दिखाया। प्रतिशत स्टॉक आईएसओ 20 परकोल समाधान की प्रत्येक परत को जोड़ना चुनौतीपूर्ण हो सकता है, और यदि वे मिश्रण करते हैं तो आपको फिर से शुरू करना होगा।
यह प्रक्रिया प्रवाह साइटोमीटर और विटर प्रयोगों में मदद करती है, इसलिए आप विभिन्न गुर्दे की कोशिका प्रकार की आबादी का अध्ययन नहीं कर सकते हैं। यह प्रक्रिया हमें गुर्दे में बी-कोशिकाओं का अध्ययन करने की अनुमति देती है और साहित्य में बहुत सारी जानकारी नहीं है।
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
