Immunology and Infection
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Analisi della proteinuria, infiltrazione renale dei leucociti e deposizione renale di proteine in topi MRL/lpr inclini al lupus
Chapters
Summary June 8th, 2022
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Il presente protocollo descrive un metodo per monitorare la progressione del lupus nei topi. Vengono presentate due procedure aggiuntive per caratterizzare la nefrite da lupus basate sull'infiltrazione cellulare e sulla deposizione di proteine nei reni.
Transcript
Questi metodi possono aiutare a studiare la progressione dell'infiammazione cronica associata ai reni nei pazienti con lupus. Offriamo un'alternativa affidabile ed economica che può essere utilizzata per monitorare il decorso della malattia nel lupus. Iniziare a sterilizzare il cappuccio spruzzando il 70% di etanolo e posizionare un foglio di plastica sterile sulla superficie.
Quindi preparare punte, tubi da 1,5 millilitri e una pipetta per raccogliere circa 20 microlitri di urina. Prendi la gabbia e spruzza il 70% di etanolo prima di metterlo all'interno del cappuccio. Successivamente, tieni il mouse con una mano e usa l'altra mano per massaggiare delicatamente l'area ventrale dall'alto verso il basso.
Utilizzando un tubo da 1,5 millilitri o una pipetta, raccogliere direttamente l'urina. O se le gocce del campione lo raccolgono dal foglio di plastica. Quindi rimetti il mouse nella gabbia.
Tagliare i reni sezionati in granulometria e digerire in cinque millilitri di tampone di digestione contenente collagenasi e DNasi 1 in terreno RPMI 1640 contenente HEPES per un'ora con agitazione continua delicata a 37 gradi Celsius. Aggiungere 10 millilitri di PBS ghiacciato contenente 10 millimolari di EDTA e incubare per 10 minuti su ghiaccio. Quindi vortice la sospensione due volte.
Successivamente, filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro da 100 micrometri e lavare con 10 millilitri di HBSS pieno. Successivamente, centrifugare a 350 volte G per 10 minuti a temperatura ambiente. Preparare una soluzione isotonica Percoll al 30, 37% e 70% e aggiungere uno strato di soluzione Percoll al 37% sopra la soluzione al 70%.
Risospendere le cellule in cinque millilitri di 30% di Percoll isotonico di serie. Utilizzando una pipetta Pasteur caricare lentamente il 37% di cinque millilitri superiore e il 70% di cinque millilitri sul fondo, rendendo il gradiente Percoll isotonico di serie. Quindi, centrifugare con il numero nove e il numero zero a 1000 volte G per 30 minuti a temperatura ambiente.
Successivamente, raccogliere i leucociti dall'interfaccia dal 37 al 70% e risospenderli in cinque millilitri di C 10. Anche in questo caso, centrifugare a 350 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Successivamente risospendere il pellet cellulare in tre millilitri di tampone fax e centrifugare a 350 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius.
Quindi scartare il surnatante lasciando circa 50 microlitri del volume totale. Aggiungere 50 microlitri di blocco del recettore FC per provetta. Seguire questo mescolare e incubare sul ghiaccio al buio per 10 minuti.
Successivamente, aggiungere due millilitri di buffer fax per il lavaggio. Quindi, centrifugare a 350 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius e scartare il surnatante lasciando circa 50 microlitri del volume totale. Quindi, aggiungere 20 microlitri del colorante fluorescente appropriato e lasciare riposare per 15-30 minuti sul ghiaccio.
Aggiungere 50 microlitri di miscela di anticorpi per tubo contenente CD 138 brilliant violet seven 11 e CD 45 Alexa Fluor 700 e incubare su ghiaccio al buio per 15-30 minuti. Successivamente, aggiungere tre millilitri di buffer fax. Centrifugare a 350 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius.
Rimuovere il surnatante sottovuoto lasciando circa 50 microlitri del volume totale. Successivamente, risospendere il pellet cellulare in 200 microlitri di PBS. Per raccogliere il campione incorporare il mezzo rene nel piccolo criomold di plastica con il composto della temperatura di taglio ottimale.
Quindi aggiungere ghiaccio secco in una scatola di polistirene espanso e posizionare con cura il criomold sopra il ghiaccio secco. Quindi, rimuovere il criostampo, avvolgerlo in un foglio di alluminio e conservarlo a meno 80 gradi Celsius fino a un ulteriore utilizzo. Quindi fissare l'asciutto a quattro sezioni micrometriche con acetone freddo per 10 minuti.
Dopo aver fissato i vetrini, asciugare all'aria per 0,5 a un'ora e conservarli a meno 20 gradi Celsius per un breve periodo o meno 80 gradi Celsius per un lungo periodo. Per colorare i campioni, rifissare i vetrini in acetone freddo per cinque-10 minuti e lasciare che le sezioni si riscaldino a temperatura ambiente. Successivamente, usando una penna a pat, disegna un cerchio idrofobo attorno alla sezione e lasciala asciugare.
Quindi posizionare i vetrini in TBS nel barattolo Copeland per 20 minuti e agitare delicatamente mettendo il barattolo sullo shaker. Successivamente, versare TBS e riempire il barattolo con TBS 5% BSA e 0,1% TW 20. Successivamente, incubare il barattolo per 20 minuti agitando delicatamente sullo shaker.
Quindi, estrarre le diapositive e pulire la parte inferiore delle diapositive. Aggiungere 100 microlitri di anticorpi coniugati C3 fit C e IgG2 APE alla sezione e incubare la temperatura ambiente in una camera umidificata per un'ora. Lavare la sezione tre volte in PBS 5% BSA e 0,1% TW 20 per 10 minuti sullo shaker e quindi agitare asciugare i vetrini.
Montare la sezione con un reagente anti-sbiadimento e poi con un vetrino di copertura. Quindi conservare i vetrini a quattro gradi Celsius fino alla visualizzazione al microscopio. Per l'analisi delle immagini utilizzando il software image J, delineare la regione desiderata.
Successivamente, impostare i parametri standard facendo clic su analizza, quindi impostare le misurazioni e misurare l'area per ottenere i risultati. Quindi, trasferire i dati ottenuti dalle finestre di misura a un foglio di calcolo. Una volta fatto, fai clic su analizza per misurare la regione e trasferire nuovamente i dati sul foglio di calcolo precedente.
I livelli di proteine nelle urine dei topi MRL LPR sono stati rilevati nel tempo in cui sono stati trattati con soluzione salina tamponata fosfato come gruppo di controllo e lactobacillus reuteri come gruppo di trattamento. Il gruppo di topi trattati con L.reuteri a una progressione della proteinuria più aggressiva rispetto al gruppo di controllo. L'analisi fax è stata eseguita per i leucociti renali isolati per analizzare le plasmacellule.
Inoltre, i topi sono stati trattati con vancomicina o vancomicina insieme a DNA a doppio filamento di Escherichia coli. Sebbene ci si aspettasse che il DNA a doppio filamento di Escherichia coli inneschi l'infiltrazione renale, non è stata riscontrata alcuna differenza significativa nella percentuale di plasmacellule. Il complemento C3 e IgG2a sono stati rilevati attraverso la colorazione con immunofluorescenza su sezioni renali MRL IPR femminili.
I fattori ambientali effettivi sulla deposizione renale di C3 e IgG2a sono stati confrontati per il pane per topi interno nella struttura per animali e quelli acquistati da un fornitore. L'analisi immunoistochimica non ha mostrato alcuna differenza tra i due gruppi. L'aggiunta di ogni strato della soluzione percentuale ISO 20 Percoll può essere impegnativo e, se si mescolano, è necessario ricominciare da capo.
Questa procedura aiuta con il citometro a flusso e negli esperimenti di Vitter, quindi non è possibile studiare i diversi tipi di cellule renali delle popolazioni. Questa procedura ci consente di studiare gli infiltrati delle cellule B nei reni e non ci sono molte informazioni in letteratura.
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