Immunology and Infection
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Análisis de proteinuria, infiltración renal de leucocitos y depósito renal de proteínas en ratones LMR/LPR propensos al lupus
Chapters
Summary June 8th, 2022
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El presente protocolo describe un método para rastrear la progresión del lupus en ratones. Se presentan dos procedimientos adicionales para caracterizar la nefritis lúpica basada en la infiltración celular y la deposición de proteínas en los riñones.
Transcript
Estos métodos pueden ayudar a investigar la progresión de la inflamación crónica asociada con los riñones en pacientes con lupus. Estamos ofreciendo una alternativa confiable y rentable que se puede utilizar para controlar el curso de la enfermedad en el lupus. Comience a esterilizar la campana rociando etanol al 70% y coloque una lámina de plástico estéril en la superficie.
Luego prepare puntas, tubos de 1,5 mililitros y una pipeta para recoger unos 20 microlitros de la orina. Tome la jaula y rocíe etanol al 70% antes de colocarla dentro de la campana. Después, sostenga el mouse con una mano y use la otra mano para masajear suavemente el área ventral de arriba a abajo.
Con un tubo o pipeta de 1,5 mililitros, recoja la orina directamente. O si la muestra gotas recógela de la lámina de plástico. Luego vuelva a colocar el mouse en la jaula.
Corte los riñones disecados en tamaño de grano y digiera en cinco mililitros de tampón de digestión que contenga colagenasa y DNasa 1 en medio RPMI 1640 que contiene HEPES durante una hora con agitación suave continua a 37 grados centígrados. Añadir 10 mililitros de PBS helado que contenga 10 milimolares de EDTA e incubar durante 10 minutos sobre hielo. Luego vortex la suspensión dos veces.
Posteriormente, filtre la suspensión celular a través de un colador de 100 micrómetros y lave con 10 mililitros de HBSS lleno. Después, centrifugar a 350 veces G durante 10 minutos a temperatura ambiente. Prepare una solución isotónica de Percoll al 30, 37 y 70% y agregue una capa de solución de Percoll al 37% sobre la solución al 70%.
Re suspender las células en cinco mililitros de 30% de stock isotónico Percoll. Usando una pipeta Pasteur cargue lentamente el 37% de cinco mililitros en la parte superior y el 70% de cinco mililitros en la parte inferior, lo que hace que el gradiente isotónico estándar de Percoll. Luego, centrifugar con el número nueve arriba y el número cero hacia abajo a 1000 veces G durante 30 minutos a temperatura ambiente.
Después, recoger leucocitos de la interfaz 37 a 70% y volver a suspenderlos en cinco mililitros de C 10. Nuevamente, centrifugar a 350 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Posteriormente, vuelva a suspender el pellet celular en tres mililitros de tampón de fax y centrifugar a 350 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.
Luego deseche el sobrenadante dejando unos 50 microlitros del volumen total. Agregue 50 microlitros de bloqueo del receptor FC por tubo. Después de esta mezcla e incubar en hielo en la oscuridad durante 10 minutos.
Más tarde, agregue dos mililitros de búfer de fax para lavar. Luego, centrifugar a 350 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados y desechar el sobrenadante dejando unos 50 microlitros del volumen total. A continuación, agregue 20 microlitros del tinte fluorescente apropiado y déjelo reposar durante 15 a 30 minutos en hielo.
Añadir 50 microlitros de mezcla de anticuerpos por tubo que contenga CD 138 violeta brillante siete 11 y CD 45 Alexa Fluor 700 e incubar en hielo en la oscuridad durante 15 a 30 minutos. Después, agregue tres mililitros de búfer de fax. Centrifugar a 350 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.
Retirar el sobrenadante al vacío dejando unos 50 microlitros del volumen total. Posteriormente, se vuelve a suspender el pellet celular en 200 microlitros de PBS. Para recoger la muestra, incruste la mitad del riñón en el pequeño criomold de plástico con el compuesto de temperatura de corte óptimo.
Luego agregue hielo seco en una caja de espuma de poliestireno y coloque cuidadosamente el criomold sobre el hielo seco. A continuación, retire el molde criogénico, envuélvalo en papel de aluminio y guárdelo a menos 80 grados centígrados hasta que se vuelva a usar. Luego fije las secciones secas a cuatro micrómetros con acetona fría durante 10 minutos.
Después de fijar los portaobjetos, seque al aire durante 0,5 a una hora y guárdelos a menos 20 grados centígrados durante un corto período de tiempo o menos 80 grados centígrados durante mucho tiempo. Para teñir las muestras, vuelva a fijar los portaobjetos en acetona fría durante cinco a 10 minutos y deje que las secciones se calienten a temperatura ambiente. Después, usando un bolígrafo, dibuje un círculo hidrófobo alrededor de la sección y deje que se seque.
Luego coloque las diapositivas en TBS en el frasco de Copeland durante 20 minutos y agite suavemente colocando el frasco en la coctelera. Posteriormente, vierta TBS y llene el frasco con TBS 5% BSA y 0.1% TW 20. Más tarde, incubar el frasco durante 20 minutos agitando suavemente sobre la coctelera.
Luego, saque las diapositivas y limpie la parte inferior de las diapositivas. Agregue 100 microlitros de anticuerpos conjugados C3 fit C e IgG2 APE a la sección e incube la temperatura ambiente en una cámara humidificada durante una hora. Lave la sección tres veces en PBS 5% BSA y 0.1% TW 20 durante 10 minutos en la coctelera y luego seque las diapositivas.
Monte la sección con un reactivo antidecoloración y luego con un cubreobjetos. Luego guarde los portaobjetos a cuatro grados centígrados hasta que los vea bajo el microscopio. Para el análisis de imágenes utilizando el software de imagen J, describa la región deseada.
Luego, establezca parámetros estándar haciendo clic en analizar y luego establecer mediciones y área de medición para obtener los resultados. A continuación, transfiera los datos obtenidos de las ventanas de medida a una hoja de cálculo. Una vez hecho esto, haga clic en analizar para medir la región y transferir los datos nuevamente a la hoja de cálculo anterior.
Los niveles de proteína en la orina de ratones LMR LMR se detectaron a lo largo del tiempo, donde fueron tratados con solución salina tamponada con fosfato como grupo control y lactobacillus reuteri como grupo de tratamiento. El grupo de ratones tratados con L.reuteri en una progresión de proteinuria más agresiva que el grupo control. El análisis por fax se realizó para los leucocitos renales aislados para analizar las células plasmáticas.
Además, los ratones fueron tratados con vancomicina o vancomicina junto con ADN bicatenario de Escherichia coli. Aunque se esperaba que el ADN bicatenario de Escherichia coli desencadenara la infiltración renal, no se encontraron diferencias significativas en el porcentaje de células plasmáticas. El complemento C3 e IgG2a se detectaron mediante tinción de inmunofluorescencia en secciones renales de LMR IPR femenino.
Los factores ambientales efectivos en la deposición renal de C3 e IgG2a se compararon para el pan de ratones interno en la instalación para animales y los comprados a un proveedor. El análisis inmunohistoquímico no mostró ninguna diferencia entre los dos grupos. Agregar cada capa de la solución ISO 20 Percoll de stock porcentual puede ser un desafío, y si se mezclan, debe comenzar de nuevo.
Este procedimiento ayuda con el citómetro de flujo y los experimentos in vitter, por lo que no se pueden estudiar los diferentes tipos de poblaciones de células renales. Este procedimiento nos permite estudiar los infiltrados de células B en los riñones y no hay mucha información en la literatura.
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