Immunology and Infection
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Lupus Eğilimli MRL/lpr Farelerde Proteinüri, Lökositlerin Renal İnfiltrasyonu ve Proteinlerin Renal Birikimi Analizleri
Chapters
Summary June 8th, 2022
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Mevcut protokol, farelerde lupus ilerlemesini izlemek için bir yöntem açıklamaktadır. Böbreklerde hücre infiltrasyonu ve protein birikimine bağlı lupus nefritini karakterize etmek için iki ek prosedür sunulmuştur.
Transcript
Bu yöntemler, lupus hastalarında böbreklerle ilişkili kronik inflamasyonun ilerlemesini araştırmaya yardımcı olabilir. Lupusta hastalığın seyrini izlemek için kullanılabilecek güvenilir ve uygun maliyetli bir alternatif sunuyoruz. % 70 etanol püskürterek davlumbazın sterilize edilmesine başlayın ve yüzeye steril bir plastik tabaka yerleştirin.
Daha sonra yaklaşık 20 mikrolitre idrar toplamak için uçlar, 1,5 mililitrelik tüpler ve bir pipet hazırlayın. Kafesi alın ve kaputun içine yerleştirmeden önce% 70 etanol püskürtün. Daha sonra, fareyi bir elinizle tutun ve ventral bölgeye yukarıdan aşağıya nazikçe masaj yapmak için diğer elinizi kullanın.
1,5 mililitrelik bir tüp veya pipet kullanarak idrarı doğrudan toplayın. Veya numune düşerse plastik tabakadan toplayın. Sonra fareyi tekrar kafese koyun.
Disseke edilmiş böbrekleri tane büyüklüğüne kesin ve HEPES içeren RPMI 1640 ortamında Kollajenaz ve DNaz 1 içeren beş mililitre sindirim tamponunda bir saat boyunca 37 santigrat derecede sürekli hafifçe sallanarak sindirim. 10 milimolar EDTA içeren 10 mililitre buz gibi soğuk PBS ekleyin ve buz üzerinde 10 dakika kuluçkaya yatırın. Sonra süspansiyonu iki kez vorteksleyin.
Daha sonra, hücre süspansiyonunu 100 mikrometrelik bir süzgeçten süzün ve 10 mililitre HBSS dolu olarak yıkayın. Daha sonra, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 350 kez G'de santrifüj yapın. % 30, 37 ve% 70'lik bir stok izotonik Percoll çözeltisi hazırlayın ve% 70'lik çözeltinin üzerine% 37'lik bir Percoll çözeltisi tabakası ekleyin.
Re, hücreleri beş mililitre% 30 stok izotonik Percoll içinde askıya alın. Bir Pasteur pipet kullanarak üstten beş mililitrenin %37'sini ve alttan beş mililitrenin %70'ini yavaşça yükleyerek stok izotonik Percoll gradyanı oluşturur. Daha sonra, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 1000 kez G'de dokuz numaraya kadar ve sıfır numaraya kadar santrifüjleyin.
Daha sonra, lökositleri% 37 ila% 70 arayüzünden toplayın ve bunları beş mililitre C 10'da yeniden askıya alın. Yine, dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 350 kez G'de santrifüj. Daha sonra hücre peletini üç mililitre faks tamponunda yeniden askıya alın ve dört santigrat derecede beş dakika boyunca 350 kez G'de santrifüj yapın.
Ardından, toplam hacmin yaklaşık 50 mikrolitresini bırakarak süpernatantı atın. Tüp başına 50 mikrolitre FC reseptör bloğu ekleyin. Bu karışımı takiben karanlıkta buz üzerinde 10 dakika kuluçkaya yatırın.
Daha sonra, yıkamak için iki mililitre faks arabelleği ekleyin. Daha sonra, dört santigrat derecede beş dakika boyunca 350 kez G'de santrifüj yapın ve toplam hacmin yaklaşık 50 mikrolitresini bırakarak süpernatenti atın. Daha sonra, 20 mikrolitre uygun floresan boya ekleyin ve buz üzerinde 15 ila 30 dakika bekletin.
CD 138 parlak menekşe yedi 11 ve CD 45 Alexa Fluor 700 içeren tüp başına 50 mikrolitre antikor karışımı ekleyin ve karanlıkta 15 ila 30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatın. Daha sonra, üç mililitre faks arabelleği ekleyin. Dört santigrat derecede beş dakika boyunca 350 kez G'de santrifüj.
Süpernatantı toplam hacmin yaklaşık 50 mikrolitresini bırakarak vakumla çıkarın. Daha sonra, hücre peletini 200 mikrolitre PBS'de yeniden askıya alın. Numuneyi toplamak için yarım böbreği en uygun kesme sıcaklığı bileşiği ile küçük plastik kriyomolda gömün.
Daha sonra bir polistiren köpük kutusuna kuru buz ekleyin ve kriyomoldu dikkatlice kuru buzun üzerine yerleştirin. Daha sonra, kriyokalıbı çıkarın, alüminyum folyoya sarın ve daha fazla kullanana kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın. Daha sonra kuruyu 10 dakika boyunca soğuk asetonla dört mikrometrelik bölüme sabitleyin.
Slaytları sabitledikten sonra, 0,5 ila bir saat boyunca hava kurutun ve kısa bir süre eksi 20 santigrat derecede veya uzun süre eksi 80 santigrat derecede saklayın. Numuneleri lekelemek için, slaytları beş ila 10 dakika boyunca soğuk asetonda yeniden sabitleyin ve bölümlerin oda sıcaklığına ısınmasına izin verin. Daha sonra, bir pat kalemi kullanarak, bölümün etrafına hidrofobik bir daire çizin ve kurumasını bekleyin.
Daha sonra slaytları TBS'ye 20 dakika boyunca Copeland kavanozuna yerleştirin ve kavanozu çalkalayıcının üzerine koyarak hafifçe çalkalayın. Daha sonra, TBS'yi dökün ve kavanozu TBS% 5 BSA ve% 0.1 TW 20 ile doldurun. Daha sonra, çalkalayıcı üzerinde hafifçe sallayarak kavanozu 20 dakika boyunca inkübe edin.
Ardından, slaytları çıkarın ve slaytların alt kısmını silin. Bölüme 100 mikrolitre konjuge antikor C3 fit C ve IgG2 APE ekleyin ve oda sıcaklığını nemlendirilmiş bir odada bir saat boyunca inkübe edin. Kesiti çalkalayıcıda 10 dakika boyunca PBS% 5 BSA ve% 0.1 TW 20'de üç kez yıkayın ve ardından slaytları kurulayın.
Bölümü bir solma önleyici reaktifle ve ardından bir kapak kaymasıyla monte edin. Ardından, mikroskop altında görüntülenene kadar slaytları dört santigrat derecede saklayın. Görüntü J yazılımını kullanarak görüntü analizi için, istenen bölgeyi ana hatlarıyla belirtin.
Daha sonra, analiz et'e tıklayarak standart parametreleri ayarlayın, ardından sonuçları almak için ölçümleri ve ölçüm alanını ayarlayın. Ardından, hesaplama pencerelerinden elde edilen verileri bir e-tabloya aktarın. İşiniz bittiğinde, bölgeyi ölçmek ve verileri tekrar önceki e-tabloya aktarmak için analiz et'e tıklayın.
MRL LPR farelerinin idrarındaki protein düzeyleri zamanla tespit edildi ve kontrol grubu olarak fosfat tamponlu salin ve tedavi grubu olarak lactobacillus reuteri ile tedavi edildi. L.reuteri ile tedavi edilen fare grubu, kontrol grubundan daha agresif bir proteinüri progresyonunda. İzole böbrek lökositlerinin plazma hücrelerini analiz etmesi için faks analizi yapıldı.
Ayrıca, fareler Escherichia coli çift sarmallı DNA ile birlikte vankomisin veya vankomisin ile tedavi edildi. Escherichia coli çift sarmallı DNA'nın renal infiltrasyonu tetiklemesi beklenmesine rağmen, plazma hücrelerinin yüzdesinde anlamlı bir fark bulunamadı. Kompleman C3 ve IgG2a, kadın MRL IPR böbrek kesitlerinde immünofloresan boyama ile saptandı.
C3 ve IgG2a'nın böbrek birikimi üzerindeki etkili çevresel faktörler, hayvan tesisindeki kurum içi fare ekmeği ve bir satıcıdan satın alınanlar için karşılaştırılmıştır. İmmünohistokimyasal analiz iki grup arasında herhangi bir fark göstermedi. ISO 20 Percoll çözümünün her bir katmanını stok yüzdesinin her bir katmanını eklemek zor olabilir ve eğer karışırlarsa yeniden başlamanız gerekir.
Bu prosedür akış sitometresine ve in vitter deneylere yardımcı olur, bu nedenle farklı böbrek hücresi tipi popülasyonlarını inceleyemezsiniz. Bu prosedür, böbreklere sızan B hücrelerini incelememize izin verir ve literatürde çok fazla bilgi yoktur.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
