Neuroscience
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Isolering av musens primære mikroglia ved magnetisk aktivert cellesortering i dyremodeller av demyelinering
Chapters
Summary April 5th, 2022
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Her presenterer vi en protokoll for å isolere og rense primærmikroglia i dyremodeller av demyeliniserende sykdommer, ved hjelp av kolonne magnetisk aktivert cellesortering.
Transcript
Denne protokollen bidrar til å isolere mikroglia fra de mikrodissekterte demyelinasjonslesjonene i den voksne musehjernen for å studere de mikrogliale egenskapene i vivo. Denne teknikken sparer tid og har lavere krav til både eksperimenter og utstyr. Denne metoden bidrar til å isolere mikroglia fra dyrets hjerne, spesielt de mikrodisserte vevene i ulike sykdomstilstander.
Begynn med å mikroskopere lesjonene merket med nøytralt fargestoff rundt corpus callosum under et stereomikroskop. Sentrifuger det dissekerte vevet ved 300 ganger g i 30 sekunder for å samle prøven nederst på røret. Forvarm enzym bland en og enzym bland to til 37 grader Celsius i en inkubator.
Tilsett deretter 1950 mikroliter for forvarmet enzymblanding en til en prøve, og fordøye i en inkubator ved 37 grader Celsius i fem minutter. Tilsett 30 mikroliter forvarmet enzymblanding to, og bland forsiktig. Etter fordøyelsen, tilsett fire milliliter kald PBS til røret, og rist forsiktig.
Sentrifuger vevsprøvene ved 300 ganger g i 10 minutter ved fire grader Celsius, og aspirer supernatanten sakte og helt. Resuspend cellepellet forsiktig med 1550 mikroliter kald PBS. Tilsett 450 mikroliter av den kalde løsningen for fjerning av rusk, og bland dem godt.
Bruk en pipette på 1000 mikroliter til å legge blandingen svært sakte over, og forsiktig med to milliliter kald PBS. Sentrifuger blandingen, og se deretter etter de tre lagene. Bruk en pipette på 1000 mikroliter til å aspirere de to øverste lagene fullstendig, og fyll røret opptil fem milliliter med kaldlastebuffer.
Snu røret forsiktig tre ganger. Deretter, etter sentrifugering og aspirasjon av supernatanten, resuspenderer cellepelleten med 90 mikroliter lastebuffer, og tilsett 10 mikroliter CD11b perler. Bland godt, og inkuber i 15 minutter ved fire grader Celsius.
Etter inkubasjonen legger du til en milliliter av lastebufferen, og vask cellene ved å forsiktig pipette væsken opp og ned med en 1000-mikroliter pipette. Sentrifuger cellene ved 300 ganger g i 10 minutter ved fire grader Celsius, og aspirer supernatanten helt for å fjerne de ubundne perlene. Resuspend cellene i 500 mikroliter av lastebufferen, og plasser MS-kolonnen med separatoren for positiv merking i magnetfeltet.
Skyll kolonnen med 500 mikroliter av lastebufferen for å beskytte cellene og sikre effektiviteten til magnetisk sortering basert på produsentens protokoll. Bruk celleopphenget på MS-kolonnen, og forkast gjennomstrømningen som inneholder cellene uten etikett. Tilsett 500 mikroliter av lastebufferen for å vaske kolonnen, og fjern den fra separatoren.
Plasser kolonnen på et sentrifugerør på 15 milliliter, og tilsett en milliliter av lastebufferen i kolonnen. Til slutt skyver du stempelet til bunnen av kolonnen for å skylle ut de magnetisk merkede cellene. En skjematisk representasjon av gating strategien som brukes i strømning cytometri analyse av mikroglia isolert fra demyelination lesjoner av voksne mus før og etter magnetisk aktivert celle sortering er vist her.
De grafiske bildene representerer fremoverspredningshøyden og sidespredningshøyden for å merke celler, fremoverspredningsområde og fremoverspredningshøyde for merking av enkeltceller, og CD11b-FITC og CD45-APC for valg av myeloidceller og mikroglia. Andelen mikroglia har økt betydelig etter den magnetisk aktiverte cellesorteringen. Det grafiske bildet representerer gatingstrategien som brukes i strømningscytometrianalyse for levende og døde enkeltceller etter den magnetisk aktiverte cellesorteringen.
Her har 7-aminoactinomycin D og sidespredningshøyde blitt brukt til å velge levende celler. Mens du prøver denne prosedyren, husk å nøyaktig mikrodissere de demyeliniserende lesjonene under et stereomikroskop basert på nøytrale røde markeringer.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
