Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Zebrafish Corneal Wound Healing: Från nötning till sårförslutning Imaging Analysis
Chapters
Summary March 1st, 2022
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Detta protokoll fokuserar på att skada zebrafiskens okulära yta genom nötning för att bedöma den efterföljande sårförslutningen på cellulär nivå. Detta tillvägagångssätt utnyttjar en okulär burr för att delvis avlägsna hornhinnans epitel och använder svepelektronmikroskopi för att spåra förändringar i cellmorfologi under sårförslutning.
Transcript
Hornhinnans transparens är avgörande för att rensa synen. I patologiska sammanhang kan denna öppenhet vara en utmaning. Att studera patogenesmekanismen kräver enkla modeller med hög likhet med det mänskliga organet.
I dessa aspekter är zebrafisk en utmärkt modell. Och det här är den första detaljerade beskrivningen av hornhinnans nötning i zebrafisk. Denna teknik är ett enkelt och snabbt sätt att inducera ytinträde i ögat.
Sårförslutningen kan enkelt följas efter nötning. Dessutom kan kemikalier eller specifika faktorer tillsättas till tankvattnet för att studera deras inverkan på sårförslutning. Eftersom såret skapas manuellt kräver metoden viss övning för att få konsekventa resultat.
Före experimentet, förbered en 0,02% arbetslösning av trikain. Tina 2 ml 0,4% lagerlösning. Lägg till 40 ml systemvatten.
Och placera lösningen i en liten behållare. Ha den oftalmiska burren redo genom att kontrollera om burrspetsen är ren. Och om det behövs, ta bort cellskrot med en fuktig bomullspinne.
Gör ett snitt på sidan av en mjuk svamp. Och fukta svampen med systemvatten. Placera svampen på scenen i ett dissekerande mikroskop.
Se till att det finns tillräckligt med arbetsutrymme för att använda burren. Och tillräckligt med belysning från sidan och över för att se ögonytan korrekt. Placera försiktigt den bedövade fisken med en sked i snittet på svampen med huvudet utskjutande från svampytan.
Närma dig försiktigt ögonytan med burrspetsen. Och börja flytta spetsen på ögonytan med en cirkulär rörelse. När nötningen är klar, placera försiktigt fisken i färsksystemet vatten som innehåller smärtstillande medel för återhämtning.
Rengör burren omedelbart efter användning med en fuktig bomullspinne. Plocka upp fisken vid önskad tidpunkt och placera den i 0,02% trikainlösning. Håll djuret i lösningen tills den operkulära rörelsen har upphört helt och fisken reagerar inte på beröring.
Lägg fisken på en petriskål med en sked och håll den med pincett. Halshugg fisken med dissekerande sax. Undvik att göra repor på ögonytan.
Sätt vävnaden i ett provrör innehållande 0,1 M natriumfosfat. Och skölj den med en ren buffert så att inget blod finns kvar i lösningen. Fixera vävnaden i 2,5% glutaraldehyd i 0,1 M natriumfosfat i 24 timmar vid 4 C.Ta bort fixeringslösningen och skölj provet flera gånger med 0,1 M natriumfosfat.
Dissekera provet genom att placera det på en droppe av 0,1 M natriumfosfat på en dissekeringsplatta. Skär huvudprovet i två med fin dissekerande sax. Alternativt kan du samla ögonen genom att försiktigt placera spetsarna på fin pincett i ögonhålorna från sidan av ögat.
Dra sedan ut ögat från uttaget och ta bort extra vävnad. Överför det dissekerade provet till ett rör innehållande 0,1 M natriumfosfat. Se till att det inte finns någon extra vävnad i provröret, eftersom det kan fästa på toppen av ögat under provbehandling.
Placera fästet med fliken på en hållare. Och hållaren till basen av ett dissekerande mikroskop. Placera försiktigt vävnadsprovet på fästet med fin pincett, hornhinnan uppåt.
Belägg provet med platina med lämplig anordning. Och förvara proverna vid rumstemperatur tills avbildning. Skaffa bilder av önskad förstoring.
Och använd 2000 till 2500x bilder för analys. Justera ljusstyrkan och kontrasten för att tydligt se alla cellgränser och mikroridge. Och undvik överexponerade områden i bilden.
Öppna TIFF-bilden med Fiji ImageJ 1.53. Och använd en skalstång för att ställa in skalan. Skapa en linje som är lika med skalningsfältet med verktyget Linje.
Välj Analysera. Ställ sedan in skala. Och skriv in det kända avståndet.
Öppna sedan ROI-hanteraren med menyn Analysera, Verktyg. För cellstorlek och rundhet väljer du Analysera, Ange mätningar, Formbeskrivningar. Och använd förstoringsglasverktyget för att se cellerna under förstoring.
Markera celler med Polygon-verktyget och lägg till varje val i ROI-hanteraren. Slutligen mäter du de valda cellerna och sparar mätningen. För att fortsätta med microridge-analys, se till att bilden är i 8-bitarsformat genom att klicka på menyn Bild, Skriv.
Välj sedan cellen med Polygon-verktyget. Och rensa bakgrunden genom att klicka på Redigera och sedan Rensa utanför. Jämna ut bilden en till tre gånger genom att välja Process, Smooth.
Och justera ljusstyrkan och kontrasten från Bild, Justera, Ljusstyrka/Kontrast, så att mikrokylskåpen sticker ut så tydligt som möjligt. Konvolvera bilden genom att klicka på Process, Filters, Convolve. Och förvandla det till binärt genom att klicka på Process, Binary, Make Binary.
Skelettisera sedan den svartvita bilden genom att välja Process, Binary, Skeletonize. Använd funktionen Analyserat skelett för att mäta mikroridgeparametrarna och spara värdena. Sårområdet är stängt vid tre timmar efter sår.
Men platsen där sårgränserna förenas förblir synlig. Resultaten visade att på slipade hornhinneepitele kan mikroridge observeras i vissa långsträckta celler bredvid sårstället. I vissa perifera regioner förloras mikrokylorna från mitten av cellen.
En jämförelse mellan de två perifera regionerna visade långsträckta celler med kortare genomsnittliga mikroridges, vilket indikerar cellomläggningar som en reaktion på sår. Dessa resultat tyder på att cellformförändringar korrelerar med mikroridgemodifiering och betonar heterogeniteten inom hornhinnans epitel i sårrespons. Kom ihåg att operationen kräver träning för att utföra ett homogent och reproducerbart sår.
Förutom elektronmikroskopi kan vävnaden användas för histologi, immunologiska färgningar och in situ-hybridisering. Dessa kommer att ge ytterligare insikt i cellen och molekylära förändringar under sårläkning. Att använda zebrafisk breddar vår kunskap om hornhinnebiologi.
Dessutom är denna modell utmärkt för farmakologiska studier och kan användas för att förstå mer om ögonutveckling.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
