硝基还原酶/甲硝唑介导的消融和MATLAB平台（RpEGEN）研究斑马鱼视网膜色素上皮的再生

斑马鱼的独特之处在于其再生许多不同组织类型（包括RPE）的内在能力。该协议可用于鉴定驱动RPE再生和RPE疾病相关机制的分子途径。多功能性是这种方法的主要优势。

除了研究RPE再生外，该方案还可用于检查RPE退行性过程以及RPE损伤对眼睛邻近组织的影响。哺乳动物，包括人类，无法修复由创伤或退行性疾病引起的大型RPE损伤。使用斑马鱼作为发现RPE促再生因子的工具是促进哺乳动物RPE再生的重要一步。

为了制备新鲜的10毫摩尔MTZ溶液，在受精后五天，将MTZ粉末加入到没有PTU的系统水中，并通过在37摄氏度下剧烈摇动一小时彻底混合。在室温下在台式旋转器或摇床上冷却10毫摩尔MTZ溶液一小时。为了从rpe65a：nsfB-eGFP转基因中筛选斑马鱼幼虫，使用具有488纳米激发激光的荧光立体显微镜将转基因eGFP阳性幼虫与非转基因eGFP阴性幼虫分开。

通过将直接移液到培养皿中，将筛选的幼虫立即唤醒，其中含有新鲜的1.5倍PTU，不含三卡因。在完成筛选后，将eGFP阳性幼虫进一步分离成两组培养皿，一组接受MTZ处理，一组作为未减压对照组。然后通过从消融处理皿中除去1.5X PTU并加入新鲜制作的10毫摩尔MTZ溶液来消融视网膜色素上皮。

同时从未升压的控制培养皿中取出1.5倍PTU，并在没有PTU的情况下加入新鲜系统水。在正好24小时后取出10毫摩尔MTZ溶液，并在没有PTU的情况下加入新鲜的系统水。更换MTZ负极盘上没有PTU的新鲜系统水。

在受精后四天筛查eGFP阳性幼虫。eGFP在受精后四天可见，但在第五天看起来比信号强度更暗。将eGFP阳性幼虫放入六孔平板而不是培养皿中，密度不超过每孔10只幼虫进行药物治疗。

为消融和未消融的幼虫指定单独的六孔板。确定所需的 15 微摩尔 IWR-1 或体积匹配的 DMSO 车辆控制预处理的体积，并相应地将 1.5 倍 PTU 等分到锥形管中。将 IWR-1 原液加入 1.5 倍 PTU，最终浓度为 15 微摩尔 IWR-1。

将匹配体积的 DMSO 库存添加到 1.5 倍 PTU。通过涡旋充分混合，并直观地确认化合物的溶解。从六孔板中的eGFP阳性幼虫中除去1.5倍PTU，每孔加入5毫升新鲜制作的0.06%DMSO或15微摩尔IWR-1处理。

第二天消融RPE。在受精后五天，确定未升压和烧蚀六孔板所需的药理学和载体对照处理的体积，并将适当体积的没有PTU的淡水系统水或10毫摩尔MTZ溶液等分试样到锥形管中。如前所述，将 IWR-1 和 DMSO 储备溶液添加到相应的锥形管中。

通过涡旋充分混合，并直观地确认化合物的溶解。从指定的未升压和烧蚀的六孔板中去除1.5X PTU中的0.06%DMSO和15微摩尔IWR-1预处理。补充适当的新鲜系统水，无需 PTU 和 MTZ 溶液处理。

在 10 毫摩尔 MTZ 溶液中，精确 24 小时后，在 0.06% DMSO 和 15 微摩尔 IWR-1 处理液中去除，并在没有 PTU 的新鲜系统水中补充处理。在未升压的六孔板上补充0.06%DMSO和15微摩尔IWR-1处理，无需PTU的新鲜系统水。使用体视显微镜上的透射光照明监测体内消融的成功和程度，以进行遗传消融后的幼虫维持。

要使用斐济生成感兴趣的RPE区域或ROI，请打开一个八位TIFF图像，通过选择图像，变换和水平翻转来重新定向图像，使背侧向上，远端左侧。对于最后一个命令，请选择最适合该图像所需的方向性的选项。通过选择分析，工具，ROI管理器来启动ROI管理器。

使用图像、缩放并在 DAPI 和明场通道之间切换。使用键盘快捷键提高效率。确定RPE的顶端侧与外限制膜尖端相邻的点，并将此解剖标志作为ROI起点。

使用斐济工具栏中的多边形选择工具创建 RPE ROI，同时使用 DAPI 和明场图像通道以及图像缩放功能来识别顶端和基础 RPE 边界。将ROI的背端和腹端带到一个尖锐的点，而不是钝化或圆润。通过在 ROI 管理器中单击添加来添加 ROI。

通过选择更多来保存 ROI 文件，然后在 ROI 管理器中保存。双击 rpegen。m 文件，以便在编辑器窗格中打开。

在用户定义的变量部分下，rpegen。m 文件中，输入包含 roi 文件的文件夹的目录位置、tiff 图像文件以及应保存输出文件的位置。输入要导出的 mat 文件的组名以及 Brightfield 通道在 TIFF 图像堆栈中的位置。

通过单击 MATLAB 顶部编辑器菜单中的“运行”按钮来运行脚本。保存MAT文件后，将出现一个三面板图，并且还将作为PDF保存到每次图像运行的输出目录中。等到这些质量控制PDF保存到输出文件夹，最后一个数字消失了。

打开各个 PDF 并验证所有 ROI 是否与明场图像匹配。双击rpegen_permplot。m 文件，以便在新的编辑器选项卡中打开。

在“单用户定义变量”部分下，输入包含运行 rpegen 的 MAT 文件的输出文件夹的目录位置。m 脚本。输入要加载的每个 MAT 文件名。

通过单击编辑器菜单中的“运行部分”按钮来运行脚本的此部分。在第二部分中，输入两组的名称，以便在数据 A 和数据 B 变量中进行统计比较，并在 reps 变量中指定排列模拟重复次数。此演示仅使用了 2，000 次重复，以缩短处理时间。

通过单击编辑器菜单中的“运行部分”按钮来运行脚本的此部分。运行热点图，并使用运行部分按钮对结果和 P 值部分进行独立分组。受精后5天幼虫的整个坐位损伤在筛选遗传消融时在RPE中显示出明亮的转基因表达。

未凋息的受精后6天幼虫的横向冷冻切片显示转基因表达仅限于成熟的RPE细胞，其最亮的表达仅限于RPE的中央2/3。箭头表示顶端微绒毛。对损伤后一天的消融幼虫进行横切冷冻，显示eGFP阳性细胞形态紊乱。

箭头表示皮指核。未凋息的受精后7 d幼虫的整个坐位损伤在整个眼睛中显示RPE色素沉着，并且在损伤后两天消融的幼虫在中央RPE中显示消融区没有色素。使用RpEGEN生成的图显示，在整个RPE长度上，未实施的受精后9天DMSO和IWR-1组之间存在相似性。

该图显示，在损伤后消融四天的DMSO和IWR-1组中，与任何其他治疗组相比，消融IWR-1组的总体像素强度最轻。在比较消融的IWR-1处理的幼虫和消融的DMSO处理的对照组时，中枢RPE色素沉着的差异是显着的。使用这种斑马鱼消融范式，我们已经能够识别出几种分子信号通路，例如我们在这里展示的风信号通路，它们是RPE再生的关键调节因子。