Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
CRISPR-genredigeringsværktøj til analyse af mikroRNA-klynger
Chapters
Summary April 25th, 2022
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Denne protokol beskriver en high-throughput clustered regelmæssigt interspaced short palindromic repeats (CRISPR) genredigeringsarbejdsgang til mikroRNA-klyngenetværksanalyse, der muliggør hurtig generering af et panel af genetisk modificerede cellelinjer, der bærer unikke miRNA-klyngemedlemssletningskombinationer så store som 35 kb inden for et enkelt eksperiment.
Transcript
Denne protokol bruger en CRISPR-genredigeringsarbejdsgang med høj gennemstrømning til molekylært at dissekere mikro-RNA-gener organiserede og grupperede enheder. Og for at bestemme, hvordan disse ikke-kodende RNA-netværk koordinerer kræftprogressionsveje. Denne CRISPR-genredigeringsprocedure gør det muligt for efterforskeren hurtigt at generere et helt panel af cellelinjer, der bærer unikke mikro-RNA-klynge-deletionskombinationer, samtidig med at tidskrævende DNA-vektor-subkloning undgås.
Denne metode vil give en klarere forståelse af, hvordan klyngede mikro-RNA'er fungerer kooperativt for at regulere tumorvækst, aggressivitet og lægemiddelresistens, før de oversætter mikro-RNA'er til klinikken som terapeutiske og diagnostiske værktøjer. Grace Yi, en forskningsassistent i mit laboratorium, demonstrerer proceduren. Til at begynde med skal du oprette en DNA-fil, der indeholder den komplette genomiske sekvens af mikro-RNA-klyngeregionen af interesse i mindst en kilobyte af omgivende genomiske regioner ved hjælp af et DNA-sekvensannoteringssoftwareprogram.
Design derefter fire unikke CRISPR RNA'er for hvert målrettet mikro-RNA-locus. To designede CRISPR-RNA'er til straks at målrette gratis DNA-sekvenser fem prime af mikro-RNA-hårnålklyngen og to designede CRISPR-RNA'er til at målrette gratis DNA-sekvenser straks tre prime af mikro-RNA-hårnålklyngen. Brug et funktionsredigeringsværktøj i den oprettede DNA-fil til at markere DNA-målsekvensen for hvert designet CRISPR RNA, der skal syntetiseres.
Designede og syntetiserede PCR-primere, der flankerer de målrettede mikro-RNA-klyngeregioner til genotypning af CRISPR-cellelinjer. Udfør en doxycyclinkoncentrationskurve på nyligt genererede lenti-inducerbare Cas9-cellelinjer for at bestemme de optimale betingelser for Cas9-proteininduktion. Plade fem gange 10 af de fjerde celler pr. brønd af hver seks brøndplade og vokse ved 37 grader Celsius, 5% kuldioxid, i det foretrukne medium i 24 timer.
Fortynd dox i det foretrukne medium med en endelig doxkoncentrationskurve på mellem 0 5100, 150, 250 og 500 nanogram pr. milli liter. Mærk brøndene på hver siddende seks brøndplade fra en til seks. Fjern mediet og udskift med de passende doxkoncentrationer.
Dyrk plader en til fire indtil 24 timer, 48 timer og 72 timer dox induktion og 120 timer efter dox tilbagetrækning. Høst pladens brønde på hvert tidspunkt. Behandl cellepillerne og ripabufferen til lysatisolering.
Udfør western blot-analyse med 40 mikrogram protein for at måle Cas9-proteininduktion og bestemme optimal Cas9-koncentration. På papir kortlægges de fem primære og tre primære CRISPR RNA-parkombinationer, der vil blive transected i hver brønd af en 24 brøndplade rettet mod hele mikro-RNA-klyngen, forskellige klyngede mikro-RNA-genkombinationer samt individuelle mikro-RNA-klyngemedlemmer. Plade den lenti-inducerbare støbte ni cellelinje ved fem gange 10 til de fjerde celler pr. brønd af en 24 brøndplade i det foretrukne medium, der indeholder den optimerede doxkoncentration.
Dyrk cellerne i 24 til 48 timer ved 37 grader Celsius, 5% kuldioxid for at inducere Cas9 proteinekspression. Transficer de lenti inducerbare Cas9-celler med en forberedt fem prime og tre prime guide RNA'er. Mærk fire 1,5 milliliter mikrocentrifugerør pr. målrettet mikro-RNA-locus.
I hvert rør blandes et til et molært forhold mellem sporstof-RNA og unikke CRISPR-RNA'er sammen for at danne det to mikromolære guide-RNA-kompleks. Tilsæt 2,5 mikroliter sporstof-RNA, 1,25 mikroliter af det fem primære positionerede CRISPR-RNA, 1,25 mikroliter af det tre primære positionerede CRISPR-RNA og fem mikroliter 10 millimolar tris hcl pH 7,5 buffer til et 1,5 milliliter centrifugerør. Mikrocentrifuge i 30 sekunder ved 16.000 gange G for at blande.
Inkuberes ved stuetemperatur i fem minutter. Til hvert rør ved 40 mikroliter reduceret serummedium til 10 mikroliter guide RNA-kompleks reaktion. Bland forsigtigt ved at pipettere op og ned.
I et rent 1,5 ml centrifugerør blandes to mikroliter af transfektionsreagenset og 48 mikroliter reduceret serummedium forsigtigt ved at pipettere op og ned. Inkuberes ved stuetemperatur i fem minutter. Til hvert rør, der indeholder 50 mikroliter guide-RNA-blanding, tilsættes de 50 mikroliter af det fortyndede transfektionsreagens.
Pipetter blandingen langsomt op og ned en gang for at blande. Inkuberes ved stuetemperatur i 20 minutter. Tilsæt 400 mikroliter antibiotikafrit medium suppleret med doxycyclin til hvert rør indeholdende de 100 mikroliter af guide-RNA-transfektionsblandingen.
Pipette forsigtigt at blande. Fjern mediet fra de doxycyclinducerede lenti-inducerbare Cas9-celler. Tilføj 500 mikroliter mediedoxycyclin guide RNA-transformationsblanding baseret på det eksperimentelle kort med 24 brøndplader.
Inkuber de transinficerede celler i 48 timer ved 37 grader Celsius i 5% kuldioxid. Udskift mediet med det frisklavede medium uden doxycyclin. Lad cellerne komme sig i yderligere 24 til 48 timer ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid.
Høst de transinficerede celler og forbered dig på genotypning og enkeltcellevrangforestillinger. Adskil de 150 mikroliter resuspenderede celler i tre dele. Frys en tredjedel af de transinficerede celler i medium plus 10% DMSO i cryo hætteglas til langtidsopbevaring.
Overfør en tredjedel af transinficerede celler til et rent 0,2 ml PCR-rør til genotypning. Forbered den sidste tredjedel af transinficerede celler til tælling og fortynding i et 96 brøndpladeformat for at generere enkeltcellekolonier. Ved hjælp af en 12-kanals multipipetter og et sterilt reagensreservoir tilsættes 100 mikroliter fortyndede celler pr. Brønd til to rækker af pladen for hver fortynding.
Tillad fire til seks uger for cellerne at vokse til sammenløb for enkeltcellekoloniudvidelse. Saml ca. 10 til 15 enkeltcellekolonier til genotypning. Identificer mindst tre uafhængige knockout enkeltcellekolonilinjer for hvert målrettet mikro-RNA-locus.
Bevar enkelte cellelinjer med jokertegn som kontrolelementer. Resuspend har været cellepellet i fire mikroliter af fem X DNA-polymerasebuffer, en mikroliter proteinase K, en mikroliter RNase A og nukleasefrit vand op til et samlet volumen på 20 mikroliter. Lus cellerne i termocyklen ved 56 grader Celsius i 30 minutter og 96 grader Celsius i fem minutter.
Opbevar cellelysaterne ved minus 20 grader Celsius, indtil de er klar til PCR-genotypning. Udfør en PCR-genotypereaktion ved hjælp af de designede PCR-primere, der flankerer guide-RNA'et fem primære og tre primære guide RNA-målrettede steder. Kør PCR-reaktionen i en termocyklist ved hjælp af det program, der er nævnt i tekstmanuskriptet.
Læg PCR-produkterne på en 1% agarosegel til elektroforeseanalyse. Ekstrahers DNA fra de isolerede PCR-fragmenter af den forudsagte molekylære størrelse for knockout-genotyperne. Forbered prøverne til DNA-sekventering.
Valider, at CRISPR-reaktionen var vellykket, og udfør DNA-sekventering af de isolerede PCR-fragmenter for at identificere Cas9-spaltningsstedet og bekræfte mikro-RNA-locus-deletion. Unikke CRISPR RNA'er blev designet, der målrettede hele 35 kilo baser miR-888 klyngeregion. Mindre klyngekombinationer inden for miR-743-familien eller miR-891-familien samt mikro-RNA-deletioner.
Gelelektroforeseanalyse af PCR-reaktionerne viste, at den forudsagte DNA-fragmentstørrelse, der repræsenterer knockout-genotypen, blev forstærket for hver CRISPR-transfektion. Enkeltcellekolonier blev genotypet af PCR i sekvensverificeret. DNA-sekventering af disse isolerede knockout PCR-fragmenter bekræftede, at de transficerede fem primære og tre primære guide-RNA'er rettede Cas9-spaltningsligation ca. tre nukleotid opstrøms for PAM-stederne og valideret genomisk tab af det målrettede mikro-RNA-locus.
WST-1 spredningsassays, der sammenligner miR-891a knockout- og vildtypeceller, bekræfter, at overekspression af mikro-RNA-mimisk lentiviral vektor inducerer prostatacellevækst, og derfor blev det forudsagt, at miR-891 et tab ville vise gensidige virkninger. Udover omhyggelig vejledning RNA-design er det vigtigt hurtigt at generere enkeltcellekolonier gennem hver mikro RNA knockout-linje. Det er især relevant, hvis mikro-RNA-knockoutcellerne har reduceret levedygtighedsvækst og let kan udkonkurreres i blandede populationer med vildtypeceller.
Yderligere metoder såsom kvantitativ realtime PCR, northern blotte og RNA-sekventering bør udføres for at bekræfte, at CRISPR-knockoutcellelinjerne ikke udtrykker modent mikro-RNA for det slettede locus.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
