מיצוי בקנה מידה קטן של Caenorhabditis elegans דנ"א גנומי

פיתחנו שיטה קלה, מהירה וחסכונית לחילוץ דנ”א גנומי של C.elegans שעובדת נהדר עבור יישומי כיתה ומחקר. ניתן להשתמש בפרוטוקולים אלה באופן אמין כדי לייצר במהירות תבניות דנ”א מדגימה אחת או קטנה של C.elegance עבור יישומים מבוססי PCR. משתמשים שאין להם ניסיון בקטיף תולעים או בשימוש במיקרו-פיפטר עשויים להתקשות בשלבים הדורשים מיומנויות אלה.

צפייה במתרגל מיומן ותרגול עשויים לעזור. מי שידגים את הנוהל יהיה פרחאן לקדאוולה, סטודנט בכיר לתואר שני מהמעבדה שלי. לצורך חילוץ דנ”א מתולעת Caenorhabditis elegans אחת, ראשית, קבעו את תוכנית הליזיס המורכבת ממחזור אחד בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולאחר מכן 95 מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות בתרמוציקלר.

כדי להכין את תמיסת הליזיס, ראשית, הוסיפו 0.8 מיקרוליטרים של תמיסת מיצוי מהקיט לקיר הפנימי של צינור PCR 0.2 מיליליטר על קרח. לאחר מכן מוסיפים 0.2 מיקרוליטרים של תמיסת הכנת רקמות מהערכה לטיפת תמיסת המיצוי ומערבבים על ידי ליטוף. עם בחירת תולעת למיצוי דנ”א, ראשית, זהה בעל חיים L4 או בעל חיים בוגר תחת מיקרוסקופ ניתוח.

ניתן לזהות הרמפרודיט L4 על ידי פות אופייני הנראה כחצי עיגול חיוור במרכז החיה. כדי לזהות הרמפרודיט בוגר, בחר את אחת מהחיות הגדולות ביותר בצלחת שעשויות להיות להן עוברים סגלגלים הנראים ברחם שלה. לאחר מכן, באמצעות בחירת חוט פלטינה, להעביר את החיה שנבחרה לתמיסה.

כדי לאסוף את התוכן בתחתית הצינור, צנטריפוגה של הצינור במשך שתיים עד שלוש שניות ב 2000 x g בטמפרטורת החדר. לאחר מכן הניחו את הצינור בתרמוציפלר, והריצו את תוכנית הליזיס שנקבעה קודם לכן. לאחר שתוכנית ליזיס זו מסתיימת, צנטריפוגה קצרה של הצינור והניחו אותו על הקרח.

לאחר מכן הוסיפו 0.8 מיקרוליטרים של תמיסת נטרול מהערכה וערבבו על ידי צנרת. שוב, צנטריפוגה של הצינור במשך שתיים עד שלוש שניות ב 2000 x g בטמפרטורת החדר. אם לא נעשה שימוש מיידי בליזאט, אחסן את הצינור בארבע מעלות צלזיוס לשימוש עתידי.

כדי לחלץ דנ”א מתולעים בודדות גם, ראשית, קבעו את תוכנית הליזיס של מחזור אחד ב-55 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולאחר מכן 95 מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות בתרמוציקלר. לאחר מכן להכין את תמיסת lysis על ידי הוספת שני microliters של תמיסת המיצוי מן הערכה על הקיר הפנימי של צינור PCR 0.2 מיליליטר על קרח, ולאחר מכן תוספת של 0.5 microliters של תמיסת הכנת הרקמה מן הערכה טיפה של תמיסת מיצוי, ולאחר מכן לערבב את התוכן על ידי pipetting. לאחר זיהוי L4 או בעלי חיים בוגרים, השתמש בחוט פלטינה כדי להעביר מספר מספיק של בעלי חיים לתמיסה.

לאחר מכן, צנטריפוגה של הצינור למשך שתיים עד שלוש שניות בטמפרטורה של 2000 x g בטמפרטורת החדר, ואז למקם את הצינור בתרמוציפלר ולהפעיל את תוכנית הליזיס שנקבעה בעבר. לאחר סיום התוכנית, צנטריפוגה לזמן קצר את הצינור ולהניח אותו על קרח. לאחר מכן מוסיפים שני מיקרוליטרים של תמיסת הנטרול מהערכה לצינור ומעורבבים על ידי צנרת.

שוב, צנטריפוגה של הצינור במשך שתיים עד שלוש שניות ב 2000 x g בטמפרטורת החדר. אם לא נעשה שימוש מיידי, אחסן את הליזאט בארבע מעלות צלזיוס לשימוש עתידי. הדנ”א הגנומי שחולץ על ידי הפרוטוקול יכול לשמש בהצלחה כתבנית PCR, הן הערכה המסחרית והן שיטת הפרוטאינאז K המסורתית ייצרו דנ”א עם רמות דומות של הגברת PCR של מוצר זוג בסיסים 2100 ומוצר זוג בסיסים של 500.

שיטת הערכה לתזת DNA סיפקה גם תבניות PCR יעילות למגוון אנזימי פולימראז DNA. אפילו בדילולים שונים, הדנ”א שחולץ מבעל חיים יחיד על ידי הערכה המסחרית תמך בהגברת PCR של מקטע דנ”א זוגי של 2100 בסיסים עם יעילות שווה ערך. עם זאת, ההגברה של מקטע דנ”א של זוג בסיסים בן 500 בסיסים השתנתה בהתאם לריכוז התבנית.

התאמתו של הדנ”א המופק מבעל חיים יחיד או מבעלי חיים מרובים כתבנית PCR לקביעת הגנוטיפ הודגמה עוד יותר על ידי הגברה מוצלחת של גן והווריאנט המוטנטי שלו. מכיוון שפרוטוקול זה כולל צנרת של נפח קטן של ריאגנטים, כדי להבטיח עקביות, השתמש בתערובת מאסטר לתגובות מרובות, טכניקת צנרת טובה ופיפטות מכויילות היטב. כמו כן, סיבוב התוכן של הצינור מבטיח ליזיס תקין.

ניתן היה להגדיל את השיטה הזו, להתאים אותה למיצוי הדנ”א הגנומי של C.elegans עבור יישומים אחרים במורד הזרם, וניתן להשתמש בה כדי לחלץ דנ”א ממיני נמטודות אחרים. בהתחשב בפשטות, במהירות, בחוסן ובעלויות הנמוכות של הפרוטוקול, הוא מתאים היטב הן ליישומי מחקר והן ליישומים בכיתה שבהם הזמן והמשאבים מוגבלים.