In vivo Leituras de lesões vasculares na retina de camundongos para promover a reprodutibilidade

Este protocolo permite ao usuário medir quantitativamente marcadores clinicamente análogos de danos na imagem da retina de camundongos, o que reforça a traduzibilidade dos achados subsequentes. Esses métodos nos permitem agilizar a análise e nos dão a capacidade de comparar de forma confiável imagens entre animais experimentais. Embora esses métodos tenham sido desenvolvidos para estudar uma visão geral do modelo de camundongo, eles podem facilmente se estender à pesquisa sobre quaisquer doenças da retina que usem as mesmas técnicas de imagem.

Ligue a caixa de luz do microscópio de imagem da retina, a máquina de tomografia de coerência óptica e a plataforma aquecida do mouse. Ligue o computador e abra o programa de criação de imagens. Adicione uma gota de fenilefrina e tropicamida a cada olho.

Injete 100 microlitros de 1% de fluoresceína intraperitoneal. Acomodem o mouse na plataforma. Ajuste a altura e o ângulo da plataforma até que a visão do fundo retiniano esteja clara e focada.

Tire uma foto do fundo. Abra o software de imagem e tomografia de coerência óptica. No programa de tomografia de coerência óptica ajustar o empurrão para 10.

Pegue uma imagem de tomografia de coerência óptica, adicione 75 micrômetros distais da queimadura. Repita para os outros três quadrantes da retina. Mude a câmera para um filtro de 488 nanômetros.

Aumente o ganho da câmera para 5. Tire uma foto do fundo exatamente 5 minutos após a injeção de fluoresceína. Abra a imagem fluoresceína no software de processamento de imagem.

Duplique a imagem. Usando uma ferramenta de seleção, trace cuidadosamente os principais vasos. Ignore quaisquer vasos que se ramificam a partir desses vasos.

Na primeira imagem, exclua a seleção, deixando apenas a embarcação. Salve esta imagem mascarada. Mova a seleção para a segunda imagem, inverta a seleção e exclua, isolando o plano de fundo.

Salve esta imagem mascarada. Abra a imagem de fundo e meça a densidade integrada. Abra a imagem dos vasos, selecione o contorno dos vasos e, em seguida, meça a intensidade média.

Divida a densidade integrada do fundo pela intensidade média dos vasos, gerando a razão de vazamento para o olho. Registre essa razão de vazamento para cada olho em uma coorte experimental. Para maior controle do fundo, normalize os olhos experimentais para a razão média de vazamento dos olhos de controle não lesionados.

Abra a imagem da tomografia de coerência óptica no software de processamento de imagem. Trace as bordas da camada de células ganglionares, camada plexiforme interna, camada nuclear interna, camada plexiforme externa, camada fotorreceptora e camada RPE. Exporte os arquivos como CSV.

Meça a espessura média de cada camada e repita para cada olho na coorte experimental. Abra a imagem da tomografia de coerência óptica na imagem J.Usando a ferramenta de linha, meça a distância em que a borda superior da camada plexiforme externa é indistinta. Meça horizontalmente, mantendo a latitude onde a desorganização começa.

Calcule a soma das distâncias desorganizadas na imagem. Divida o comprimento da desorganização pelo comprimento total da retina para obter a razão de desorganização. Repita a medição e o cálculo para imagens de tomografia de coerência óptica dos outros três quadrantes da retina.

Tomemos a média das razões de desorganização das quatro imagens de tomografia de coerência óptica. Este número representa a desorganização média para toda a retina. Repetir para cada olho na coorte experimental.

As imagens mascaradas utilizadas para o cálculo da razão de vazamento para cada imagem de retina podem ser comparadas a outras e analisadas, separando a vasculatura maior de outras áreas da retina. A quantificação da fluoresceína permite a comparação da gravidade da lesão e da eficácia do tratamento, bem como o estudo das alterações no vazamento ao longo do curso do tempo da lesão. Observa-se uma delimitação das camadas da retina em uma imagem OCT.

A quantificação da espessura para cada camada retiniana mostra que a resposta edematosa inicial tem um efeito mais profundo sobre as camadas internas da retina. A partir de uma análise de um curso temporal de dano de oclusão da veia da retina, o inchaço inflamatório inicial das camadas da retina e o eventual afinamento degenerativo podem ser observados. A camada nuclear interna experimenta uma resposta muito maior à lesão inicial, mas a camada plexiforme interna demonstra um afinamento mais grave após o edema inicial ter sido estabilizado e retornar à linha de base.

A desorganização da camada interna da retina se manifesta como um desaparecimento do limite superior da camada plexiforme externa, misturando as camadas plexiformes externas e nucleares internas. A desorganização retiniana de dois grupos experimentais foi comparada para investigar a eficácia de um inibidor na mitigação do dano retiniano. A qualidade da imagem é de vital importância para a qualidade da análise.

Ao adquirir imagens da retina, reserve um tempo para garantir que as camadas de fundo e retina sejam o mais claras e focadas possível. Esses métodos não invasivos podem ser usados longitudinalmente e em conjunto com o estudo bioquímico e imuno-histoquímico do tecido para criar perfis mais multifacetados e detalhados da doença. Esta técnica permite a quantificação confiável de dados de imagem retiniana in vivo em modelos de doença neurovascular, de modo que os dados possam ser mais facilmente traduzidos para a doença humana.