Fremme høyoppløselig avbildning av virussamlinger i væske og is

Interessen for flytende elektronmikroskopi har skutt i været de siste årene, da vi nå kan visualisere på nanoskala sanntidsprosesser. Forbedret kunnskap om disse fleksible strukturene kan hjelpe oss med å utvikle nye reagenser for å bekjempe nye patogener som SARS-CoV-2. Å se proteiner i et flytende miljø bidrar til å etterligne biologiske systemer og gir oss en mulighet til å se på proteinene på en mer dynamisk måte.

Og dette eksperimentet vil vise deg nye teknikker for hvordan du bruker og visualiserer proteiner i både glassaktig is og flytende miljøer. Nylige resultater inkluderer dynamisk innsikt i vaksinekandidater i antistoffbaserte terapier avbildet i væske. Korrelative væske- og kryo-EM-applikasjoner fremmer vår evne til å visualisere molekylær dynamikk, noe som gir en unik kontekst for menneskers helse og sykdom.

Lesere som bruker konvensjonelle TEM- eller cryo-EM-teknologier, kan vurdere å implementere flytende EM-arbeidsflyter for å gi nye dynamiske observasjoner av prøvene sine på en måte som utfyller deres nåværende strategier. Kommersielt tilgjengelige væske-EM-systemer kan gi strømning, blanding, elektrokjemiske stimuli og temperaturkontroll, noe som er avgjørende for mange sanntidsbildeapplikasjoner. Microchip sandwich-metoden som presenteres her, beskriver en enkel inngangsnivå-måte å først se prøver i væske før du tar spranget til et mer komplekst kommersielt system for in situ-eksperimenter.

For å begynne, rengjør silisiumnitridmikrochips ved å inkubere hver brikke i 150 milliliter aceton i to minutter, etterfulgt av inkubasjon i 150 milliliter metanol i to minutter. La flis tørke i en laminær luftstrøm. Plasma rengjør de tørkede sjetongene ved hjelp av et glødutladningsinstrument som opererer under standardforhold i 45 sekunder ved bruk av argongass.

Deretter legger du en tørr base mikrochip inn i spissen av prøveholderen og legger rundt 0,2 mikroliter av prøven til basebrikken. Etter inkubering i ett til to minutter, plasser toppbrikken på den våte basebrikken som inneholder prøven. Plant forsamlingen sammen for å danne et hermetisk forseglet kabinett som holdes på plass mekanisk av tre messingskruer.

Pump spissen til 10 til minus seks torr ved hjelp av en turbopumpet tørr pumpestasjon. Holderen er nå klar til å settes inn i TEM. Plasma rengjør mikrochips og karbongitter ved hjelp av et glødutladningsinstrument i 45 sekunder.

Og legg rundt to mikroliter prøve til en glødutladet mikrochip plassert på en gelpakke. Fjern overflødig løsning ved hjelp av filterpapir eller en pipette og inkuber i ett til to minutter. Tilsett deretter det glødeutladede karbongitteret til den våte mikrochipen som inneholder prøven.

Plant forsamlingen sammen ved hjelp av en enkelt vippeprøveholder ved romtemperatur for å danne et hermetisk forseglet kabinett. Alternativt kan du bruke autoloader grid clips og plassere sandwichenheten på bunnen C-klips. Plasser toppklemmen på toppen av enheten og bruk standard klemmeverktøy for å forsegle enheten sammen.

Prøven er nå klar til å settes inn i TEM. Undersøk prøver plassert i auto-loaders under kryoforhold eller ved romtemperatur. For væske-EM-avbildning, last prøveholderen inn i TEM utstyrt med en feltutslippspistol og operer ved 200 kilovolt.

Slå på pistolen og juster den eusentriske høyden på mikroskoptrinnet i forhold til prøven ved å bruke wobblerfunksjonen, og vipp prøven fra minus 15 grader til pluss 15 grader i kolonnen. Denne prosedyren justerer trinnet i Z-retningen for å imøtekomme prøvetykkelsen og bidrar til å sikre en nøyaktig forstørrelse under bildeopptak. Ta opp bilder som lange innrammede filmer eller individuelle bilder ved hjelp av programvarepakken for seriell datainnsamling, og implementer automatiserte bildebehandlingsrutiner.

Skaff bilder under lavdoseforhold ved forstørrelser fra 28.000X til 92.000X og 40 bilder per sekund. Juster eksponeringstidene for å minimere stråleskader på prøven og bruk et defokusområde på minus en til fire mikrometer ved den angitte forstørrelsen. Hvis en tykk løsning oppstår, bruk høyere defokuseringsverdier eller velg et annet interesseområde.

Sørg for at løsningen er til stede i prøvene gjennom hele bildeøkten ved å fokusere elektronstrålen på et offerområde som ikke brukes til datainnsamling før bobler dannes. Analyser filmer for SARS-CoV-2-partikler ved hjelp av RELION-3.0.8-programmet eller annen bildebehandlingsprogramvare. Utfør bevegelseskorreksjon ved hjelp av MotionCor2-programmet.

Når de er korrigert, trekker du ut partikler ved hjelp av autoplukkingsverktøyet i programvarepakken for programmet. Typiske boksstørrelser er 330 piksler for flytende prøver og 350 piksler for isprøver. Beregn de første rekonstruksjonene ved hjelp av C1-symmetri med programmets 3D-modellrutine og ab initio-modellalternativene i databehandlingsprogramvarepakken.

Utfør deretter forbedringsprotokoller i databehandlingsprogramvaren. Undersøk resultatene ved hjelp av en programvarepakke for molekylær strukturanalyse mens du vurderer dynamiske endringer. En sammenligning av væske-EM- og kryo-EM-strukturer i adeno-assosiert virussubtype tre eller AAV er vist her.

De representative bildene viser strukturen til AAV i løsningen og i is. Rotasjonsvisningene av AAV VP1-underenheten ekstrahert fra væske- og isstrukturene er vist her. Disse bildene representerer de dynamiske verdiene i væskestrukturene som genereres ved hjelp av morph map-funksjonen i molekylærstrukturanalyseprogramvaren.

De gjennomsnittlige strukturene fra flere virussamlinger viser konformasjonsendringer med en endring på nesten 5% diameter målt ved hjelp av EM-data. Et bilde av SARS-CoV-2 subvirale sammenstillinger isolert fra serumfraksjoner fra Covid-19-pasienter er vist her. Disse hvite boblene indikerer tilstedeværelsen av væske i prøven.

En EM-rekonstruksjon av disse subvirale samlingene er vist her med fargede radiale tettheter på fem nanometer skiver gjennom kartet. Det representative bildet beskriver analysen av rotavirus dobbeltlags partikler fremstilt i glassaktig is ved hjelp av mikrochip-sandwichteknikken. Bruk av vaskemidler, glyserol, polyetylen, glykoler og høye nivåer av sukker bør minimeres eller unngås for væske-EM-avbildning.

Disse reagensene kan introdusere gjenstander, skape overdreven boblende, hydrolyseprodukter og frie radikaler på grunn av stråleskader. Bruken av disse protokollene vil tillate forskere å kunne studere dynamiske prosesser ved atomdetaljer. Og dette spenner over flere fagområder, inkludert medisin, biovitenskap og materialforskning.

Protokollene som presenteres her beskriver hvordan state-of-the-art verktøy kan gi et spennende middel til å visualisere biologiske makromolekyler gjennom nye øyne. Det flytende elektronmikroskopifeltet kan heve hvordan vi studerer disse nye virusene som utgjør en trussel mot menneskers helse, kanskje til og med bidrar til våre pandemiberedskapstiltak.