Biology
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Criblage à haut débit d’isolats microbiens ayant un impact sur la santé de Caenorhabditis elegans
Chapters
Summary April 28th, 2022
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Les microbes intestinaux peuvent avoir un impact positif ou négatif sur la santé de leur hôte via des mécanismes spécifiques ou conservés. Caenorhabditis elegans est une plate-forme pratique pour dépister de tels microbes. Le présent protocole décrit le dépistage à haut débit de 48 isolats bactériens pour déterminer leur impact sur la résistance au stress des nématodes, utilisés comme indicateur de la santé des vers.
Transcript
Ce protocole décrit comment dépister les bactéries ayant un impact sur la résistance au stress thermique oxydatif de C. elegans dans deux souches de C.elegans sur 48 isolats bactériens en parallèle. Cette approche est polyvalente et évolutive. Il permet un dépistage rapide de multiples affections ayant un impact sur C.elegans contre la santé, ce qui est applicable à l’étude des mécanismes de la santé et des maladies.
En utilisant la résistance au stress comme indicateur de la santé, ce pipeline est facilement applicable au criblage préclinique de médicaments, d’antiémétiques et de probiotiques sur des modèles mutants, knockdown, transgéniques et de maladies de nématodes. La capacité de tester de nombreuses conditions en parallèle permet l’étude d’interactions complexes impliquées et sert des processus physiologiques. Il s’agit notamment des interactions hôte-microbe, des troubles métaboliques, de la gestion du stress et du vieillissement.
Il est essentiel d’éviter toute contamination. Ne laissez pas les vers manquer de nourriture et effectuez des étapes clés dès que les vers atteignent le stade requis. Commencez par la préparation d’une culture concentrée de bactéries E. coli OP50 en inoculant quatre bouteilles d’un litre de bouillon de lysogénie avec deux millilitres de culture de démarrage OP50 chacune.
Ensuite, placez les bouteilles dans un incubateur à agitation pendant six heures à 37 degrés Celsius et 160 G, puis en granulant les bactéries à 3057 G et 20 degrés Celsius pendant 15 minutes. Ensuite, jetez le surnageant et remettez les granulés en suspension avec six millilitres de milieu OP50. Recueillir la culture concentrée dans un tube conique stérile de 50 millilitres.
Inoculer huit plaques NGM de six centimètres par souche avec 100 microlitres de culture OP50 saturée cultivée pendant la nuit à 37 degrés Celsius par plaque. Gardez ensuite les assiettes à 20 degrés Celsius pendant deux jours avant utilisation. Ensuite, coupez un morceau de gélose carrée de 0,5 centimètre avec des vers d’une plaque NGM récemment affamée à l’aide d’un scalpel, et transférez-le sur chacune des huit plaques NGM inoculées de six centimètres.
Incuber ces plaques à 20 degrés Celsius pendant trois jours. Ensuite, remettez les vers en suspension en ajoutant jusqu’à trois millilitres de tampon M neuf stériles aux plaques NGM de six centimètres à l’aide d’une pipette P1000, et collectez la solution de vis sans fin des huit plaques par souche dans un seul tube conique de 15 millilitres. Ensuite, centrifugez à 142 fois G pendant deux minutes à quatre degrés Celsius, et retirez délicatement le surnageant à l’aide d’une pipette P5000 ou d’une pompe à eau équipée d’une pipette ou d’un embout Pasteur stérile.
Ensuite, ajoutez 10 millilitres de tampon M neuf stériles pour laver la pastille de vers. Ensuite, retirez le surnageant et transférez les vers sur une plaque NGM inoculée OP50 de 15 centimètres complétée par de l’OP50 concentré à l’aide d’une pipette. Cultivez chaque souche de ver sur une plaque NGM de 15 centimètres de diamètre pendant trois à quatre jours à 15 degrés Celsius en réalimentant les vers avec 0,5 millilitre d’OP50 concentré par jour.
Après avoir collecté et lavé un tampon M neuf, transférer chaque culture de souche de vers sur plusieurs plaques NGM et propager les vers à 20 degrés Celsius jusqu’à ce que 95% de la population soit composée d’adultes gravides. Ensuite, blanchir les vers adultes gravides en suivant la méthode standard de préparation des œufs, et transférer les œufs sur deux plaques NGM de 15 centimètres non ensemencées pendant 24 heures à 15 degrés Celsius pour permettre à toutes les larves L one d’éclore et de croître de manière synchrone dans les étapes suivantes. Tout d’abord, collectez toute la masse bactérienne précédemment cultivée sur une plaque de gélose LB de six centimètres et transférez-la dans un tube microcentrifuge marqué de 1,5 millilitre contenant un millilitre de tampon M neuf.
Ensuite, faites tourbillonner le tube de microcentrifugeuse jusqu’à ce que les pastilles bactériennes soient complètement remises en suspension. Ensuite, faites tourner à 9, 300 fois G pendant cinq minutes à température ambiante et retirez 700 microlitres de surnageant. Encore une fois, re-suspendre la pastille bactérienne par vortex.
Ensuite, transférez 200 microlitres de chaque suspension bactérienne dans un seul puits d’une plaque vide stérile de 96 puits. À partir de cette plaque, inoculer huit plaques d’agarose NGM de 96 puits avec 10 microlitres de solution bactérienne à l’aide d’une pipette multicanal et incuber avec le couvercle à 25 degrés Celsius pendant 24 heures. Ensuite, scellez la plaque de suspension à 96 puits avec un film adhésif propre pour le plafond et conservez-la à 15 degrés Celsius jusqu’à cinq jours.
Pour commencer, évaluez le stade de développement d’une population de vers synchronisés en examinant les plaques. Une fois que plus de 90% des vers ont atteint le stade L quatre, collectez les vers dans jusqu’à 10 millilitres de solution stérile M nine dans des tubes coniques de 15 millilitres. Ensuite, lavez abondamment les vers quatre fois en tournant à 142 fois G pendant deux minutes à quatre degrés Celsius, tout en ajoutant 10 millilitres de M neuf stériles frais entre chaque lavage pour éliminer les bactéries OP50.
Ensuite, retirez le surnageant et remettez en suspension la pastille de ver dans 10 millilitres de M neuf. Transférer 50 microlitres de solution de vis sans fin dans un tube de liaison à surface basse de 1,5 ou deux millilitres contenant 950 microlitres de M neuf. Après avoir mélangé doucement le contenu du tube pour éviter la sédimentation par les vers, utilisez rapidement une pointe de pipette humide à faible liaison pour transférer trois à quatre gouttes distinctes de 10 microlitres sur une lame de verre ou une plaque NGM.
Sous un stéréomicroscope à un grossissement de 16X, compter le nombre de vers et faire la moyenne des comptes de trois à quatre gouttes pour déterminer le nombre de vers par microlitre dans la solution de vers. Ajustez la concentration de vers à 15 vers par microlitre dans le tube conique de 15 millilitres. Transférez ensuite huit microlitres de solution de vis sans fin dans chacun des puits des huit plaques d’agarose NGM de 96 puits à l’aide d’une pipette multicanal ou d’une pipette répétée.
Après 36 heures, distribuer 30 microlitres de M neuf dans chaque puits de la plaque de 96 puits. Ensuite, transférez les vers dans la plaque de 384 puits selon des dispositions définies en utilisant des pointes de rétention faibles, en veillant à ce que les lecteurs de plaques soient correctement configurés. Ensuite, complétez les 384 plaques de puits avec plus de M neuf, visant un volume final de 60 microlitres par puits en ajoutant 40 microlitres de M neuf pour le dosage du stress thermique et 34 microlitres de M neuf dans six microlitres de TBHP pour le stress oxydatif induit par le TBHP.
Commencez ensuite le test dans les deux minutes suivant l’ajout du TBHP. Ensuite, fermez les plaques avec leur couvercle transparent et scellez les bords des plaques de puits 384 avec du ruban de masquage, en veillant à ce que le ruban ne passe pas sur le couvercle ou sous la plaque. Insérez ensuite la plaque dans le lecteur de plaques.
Déterminez une valeur de fluorescence en dessous de laquelle un pic ne serait pas significativement différent du bruit et notez le premier moment où les fluctuations de fluorescence s’atténuent avant de monter. Notez ensuite les points temporels entre lesquels les valeurs de fluorescence minimale et maximale devraient baisser, car elles seront utilisées pour l’ajustement de la courbe. Ensuite, vérifiez si les amplitudes des pics de fluorescence varient de manière significative entre les puits.
Normaliser les données avant une analyse plus approfondie en utilisant la formule décrite dans le manuscrit. Tout d’abord, téléchargez LFASS depuis GitHub, lancez MATLAB et accédez au dossier LFASS. Tapez et exécutez ensuite fit folder dans la fenêtre de commande, en suivant les instructions à l’écran.
Après avoir tapé dans le dossier d’ajustement, tapez le nom de votre dossier de données dans lequel se trouve le fichier Excel en tant que Mes données. Entrez ensuite deux pour l’intervalle de temps entre les mesures successives dans le protocole actuel et tapez la valeur du seuil de bruit. Ensuite, attribuez le seuil de tolérance supérieur en tapant 0,94 et le seuil de tolérance inférieur en tapant 0,06 pour contraindre l’ajustement sigmoïde.
Définissez des intervalles de temps pour trouver les valeurs maximales et minimales. Pour inspecter visuellement les ajustements convergents, tapez Y pour oui ou N pour non pour ne pas afficher les courbes ajustées et lisses lorsque vous y êtes invité. Ensuite, fournissez de nouvelles limites de temps, inférieures et supérieures pour tenter le réaménagement.
Si vous souhaitez tenter le réaménagement, tapez deux. Mais si vous souhaitez accepter le réaménagement et passer à la courbe suivante, tapez zéro. Afin de choisir d’analyser les courbes identifiées comme bruit ou de réajuster les courbes mal ajustées, soit de type Y à approuver, soit de type N à rejeter.
Une fois que le réajustement a été tenté ou refusé pour toutes les courbes restantes, le programme prend fin. Récupérez les fichiers de résultats du dossier de résultats et enregistrez-les sous le point XLSX pour une analyse en aval. Des tests de résistance à la chaleur et au stress oxydatif ont été effectués sur Bristol N, deux vers de type sauvage, qui ont été nourris avec des isolats bactériens MYB11 ou MYB115 ou des bactéries témoins E coli OP50.
Après 36 heures, les populations adultes de vers de type sauvage ont été exposées à un stress thermique de 42 degrés Celsius et à un stress oxydatif induit par le TBHP à 7 %. Le temps médian de décès variait entre 40 et 130 minutes pour l’essai de stress thermique et entre 90 et 240 minutes pour le test de stress oxydatif. Pour vous assurer que les vers sont cultivés à l’étape 2.5 et que l’étape 2.1 peut prendre jusqu’à deux heures, dessinez une disposition de plaque pour préparer les vers de 96 puits à 284 plaques de puits à l’étape 4.6.
Des étapes peuvent être ajoutées ou remplacées. Par exemple, les criblages d’ARN à l’échelle du génome de l’hôte ou les criblages génétiques bactériens peuvent être effectués en remplaçant respectivement les clones de RNI ou les mutants bactériens par des isolats de bactéries intestinales. Nous utilisons donc actuellement cette approche pour identifier de nouveaux probiotiques et découvrir des réseaux de régulation des gènes impliqués dans les micro-interactions de l’hôte dans le contexte des infections et du vieillissement.
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