Immunology and Infection
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Induktion af øjenoverfladebetændelse og indsamling af involverede væv
Chapters
Summary August 4th, 2022
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Okulær overfladebetændelse skader det okulære overfladevæv og kompromitterer vitale funktioner i øjet. Den nuværende protokol beskriver en metode til at inducere okulær betændelse og indsamle kompromitterede væv i en musemodel af Meibomian kirtel dysfunktion (MGD).
Transcript
Denne protokol beskriver sekventielt de trin, der er involveret i induktion af okulær overfladebetændelse og indsamling af tilknyttede berørte organer involveret i meibomisk kirteldysfunktion. Denne nye model af MGD muliggør undersøgelse af medfødt immunaspekt af sygdommen, især dannelsen af neutrofile ekstracellulære fælder, der lukker den meibomiske kirtel. Teknikken udstillet i protokollen kan udvides til at introducere topiske terapeutiske interventioner i et præklinisk stadium.
Desuden afspejler indsamlingen af okulære ekssudater og organer effektiviteten af behandlingen. For at udføre intraperitoneal injektion af immunogenopløsningen skal du holde den syv til ni uger gamle C57 sorte seks ikke-bedøvede hunmus blødt ved halen, mens du griber fat i burgitteret. Hold derefter huden på ryggen og nakkeområdet fast mellem tommelfingeren og pegefingeren og fastgør halen og underbenene mellem ringen og lillefingeren mod håndfladen.
Hold musen fast med hovedet nedad, injicer 100 mikroliter af den fremstillede immunogenopløsning i højre eller venstre kvadrant i det nedre bukhule. For at udføre en okulær overfladeudfordring efter immunisering skal du anvende fem mikroliter ovalbumin eller æg eller saltvand pr. Øje af en bedøvet mus og vente i fem minutter for at få dråben absorberet af øjet. Derefter samles okulære ekssudater ved at påføre 50 mikroliter sterilt saltvand på øjet umiddelbart efter udfordringen.
Til udskæring af okulært overfladevæv skal du placere musen på en jævn overflade og desinficere kredsløbsområdet omkring øjet med en 70% ethanolpind. For at danne et snit omkring øjet skal du lave et snit mellem øret og den retroorbitale sinus og langs overfladen over pladebenet lodret og forlænge snittet vandret under det nedre øjenlåg langs den maksillære knogle og over det øvre øjenlåg langs frontbenet. Hold forsigtigt det dissekerede væv rundt om øjet ved hjælp af buede tang, og træk vævet og øjeæblet ud.
Anbring de udskårne organer i steril PBS. Brug derefter en skalpel under stereomikroskopet til at trimme det overskydende ansigtsmuskelvæv omkring de udskårne øvre øjenlåg. For at samle bindehinden placeres det øvre øjenlåg på en tør petriskål.
Brug derefter en fin pincet og en skalpel til at skrælle det hvidlige slimlag forsigtigt ud af øjenlågets indre overflade. Ved siden af dissekere hornhinden skal du placere øjenglobussen på en ny tør petriskål oven på tøris. Efter tre minutter placeres fadet på bænkoverfladen i en stabil position.
Brug fin, skarp saks til at lave et lille snit ved grænsen til hornhinden ved siden af limbus. Fortsæt snittet med skalpellen rundt om øjenkloden, og adskil sclera fra hornhinden. Fjern derefter iris- og linseresterne fra hornhindens bagside ved generøst at skylle med saltopløsning.
For at vurdere den meibomiske kirtel og dens åbninger skal du placere de udskårne øjenlåg i opretstående stilling under stereomikroskopet. Derefter i henhold til kameraets eksponeringstid og ISO-indstillinger skal du tage billeder under epi-belysning med hvidt lys. For at vurdere det meibomiske kirtelområde skal du placere de udskårne øjenlåg i vandret position og tænde baggrundsbelysningen på stereomikroskopet udstyret med et infrarødt kamera.
Tag billeder ved at justere eksponeringstiden i henhold til kameraets ISO. Saltvandsadministrerede mus viste sunde okulære overflader med vidt åbne øjne. Til sammenligning fremkalder ægapplikation alvorlig okulær overfladebetændelse, den smalle åbning af øjnene og tegn på kemose.
De udskårne øjenlåg viste store okklusioner, der tilsluttede åbningerne i den meibomiske kirtel og ødem, i modsætning til de sunde øjenlåg, der viste små stik i kirtlen, der forer øjenlåget. Yderligere undersøgelse af kirtlens infrarøde transillumination afslører det racemiske udseende af acini i den meibomiske kirtel. Øjenlågene på saltvandsudfordrede mus viste den runde acini.
Til sammenligning inducerede ægapplikationer ødelæggelse og tab af nogle kirtler med den allergiske øjensygdom eller AED. Den histologiske analyse af øjenlågene viste udvidede meibomiske kirtler sammenlignet med mus administreret med kun saltvand. Inkubering af øjet på tøris tillod snit ved hornhinden ved siden af limbus og adskillelse af hornhinden fra sclera.
Denne undersøgelse lettede indsamlingen af hornhinden. Derudover påførte ægadministration alvorlig betændelse i bindehinden med et hyperemisk udseende. Forhøjede niveauer af kemokin-CXCL-1 letter neutrofil ekstravasation, fagocytose og degranulering, og interleukin-6, der medierer det akutte faserespons og neutrofilinfiltration, blev observeret i supernatanterne hos AED-mus.
På den anden side viste koncentrationen af interleukin-10 ingen signifikante ændringer i både naive og AED-mus. Denne nye model muliggør udvikling og evaluering af effekten af lægemidler, der er målrettet mod de medfødte immunveje, og er til stor hjælp i datamining af administrationsmåden for antiinflammatoriske midler. Efter passende indsamling af organer er meget multiplexmetoder som enkeltcellesekventering og billeddannelsesmassecytometri kompatible med denne protokol.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
