Karakterisering van RNA-modificaties in enkele neuronen met behulp van massaspectrometrie

Met dit protocol introduceerden we de eerste methode die in staat is om tegelijkertijd meerdere RNA-modificaties in afzonderlijke neuronen te profileren, waardoor nieuwe onderzoeksgebieden worden geopend met post-transcriptionele regulatie in individuele cellen. Door gebruik te maken van geoptimaliseerde monstervoorbereidingsomstandigheden en vloeistofchromatografie tandem massaspectrometrie, kunnen meer dan een dozijn gemodificeerde nucleosiden worden gedetecteerd en gekwantificeerd in een enkel neuron per experiment. Individuele cellen zijn verschillend in termen van hun functies, morfologie en hun chemische profielen.

Het is belangrijk dat we in staat zijn om het volledige chemische mozaïek van deze cellen te meten, inclusief hun RNA-profielen, zodat voldoende cellen hun verschillen kunnen begrijpen, zowel in gezondheid als in ziekte. De mate van gangliapreparaat voorafgaand aan isolatie van één neuron hangt af van de voorkeuren van het individu dat de isolatie uitvoert. Probeer zowel langere als kortere proteasebehandelingen om geschikte aandoeningen te identificeren.

Plaats om te beginnen de verdoofde Aplysia californica ventrale kant omhoog in een ontleedbak. Begin het te ontleden met een chirurgische schaar met één stompe punt in de richting van het dier en maak voorzichtig een longitudinale snee door de voet. Na het vastpinnen van de rostrale, caudale en laterale zijden van het dierlijke lichaam om de interne organen en de ganglia van het centrale zenuwstelsel in de lichaamsholte bloot te leggen, isoleert u de ganglia van het primaire centrale zenuwstelsel van het dier door zenuwen en sommige verbindingen afkomstig van de ganglia operatief af te snijden.

Dompel de ganglia onder in 10 milligram per milliliter protease type XIV-oplossing van Streptomyces griseus en incubeer gedurende 30 minuten tot een uur bij 34 graden Celsius. Spoel vervolgens de ganglia zes keer met kunstmatige zeewaterantibiotische oplossing. Breng vervolgens met behulp van een polypropyleen transferpipet die is gesneden tot een opening van vijf millimeter alle ganglia over in een met siliconenpolymeer gecoate schaal gevuld met de kunstmatige zeewaterantibiotische oplossing.

Houd de ganglia altijd ondergedompeld in kunstmatig zeewater. Vervolgens, om de ganglionscheden te verwijderen, pint u de ganglia vast en gebruikt u microscissors en fijne tangen. Gebruik bij voldoende sterke enzymatische behandeling glazen of metalen naalden voor het ontheatten.

Identificeer visueel de neuronen van belang. Gebruik een gepoold glazen capillair of scherpe wolfraamnaalden om de geïdentificeerde cel zorgvuldig te isoleren van het bulkganglion. Na het tekenen van ongeveer één microliter kunstmatig zeewater in een plastic micropipette, brengt u de geïsoleerde cel over in een PCR-monsterbuis met vier microliter ammoniumacetaat van 0,365 molair ammoniumacetaat.

Verzamel voor blanco metingen vijf microliter aliquots van de kunstmatige zeewaterantibiotische oplossing uit de schaal met het ganglion en meng met de digestiebuffer. Lyse de geïsoleerde neuronen door herhaalde aspiratie en het afzien van een micropipette in 0,365 molair ammoniumacetaat. Sommige cellen kunnen niet onmiddellijk scheuren.

Om ze te lyseren, oefent u druk uit over de diameter van de cel met een gepoold glazen capillair. Verwarm vervolgens het monster in een thermische cyclus voordat u 3,375 microliter RNA-verteringsbuffer aan het monster toevoegt. Meng deze oplossing met behulp van een micropipette door de oplossing meerdere keren op te zuigen en te doseren.

Draai alle vloeistofdruppels die zich aan de wanden van de PCR-buis hechten af met behulp van een miniatuur bench top centrifuge. Incubeer vervolgens de monsters in de thermische cyclus bij 37 graden Celsius gedurende drie uur, gevolgd door een hold op 10 graden Celsius met het verwarmde deksel ingesteld op On.Zodra de monsters zijn afgekoeld, breng dan onmiddellijk zeven microliter van de oplossing over in een autosampler-injectieflacon uitgerust met een inzetstuk van 250 microliter zonder bellenvorming in de autosamplerbuis. Om het vloeistofchromatografiesysteem voor te bereiden op scheiding van de canonieke en gemodificeerde nucleosiden, moet u een C18-kolom in evenwicht brengen met 99% mobiele fase A en 1% mobiele fase B bij een stroomsnelheid van 0,2 milliliter per minuut gedurende 12 minuten bij 36 graden Celsius.

Bedien het massaspectrometrie-instrument in de positieve modus met de omleidingsklep ingesteld om te verspillen voor de eerste twee minuten van de analyse en om te sourcen voor de rest van de run. Verzamel vervolgens massaspectra over een m/z-bereik van 110 tot 600. Selecteer ionen voor botsing-geïnduceerde dissociatie bij 35 tot 40 elektronvolt gedurende een cyclustijd van drie seconden met behulp van een voorkeursmassalijst die is samengesteld uit de database en een isolatievenster van 0,5.

Gebruik actieve uitsluiting om ionen uit te sluiten van fragmentatie na drie spectra. Stel dynamische MS/MS-spectra-acquisitie in voor ionen met intensiteiten boven en onder 50.000 tellingen op respectievelijk vier Hertz en één Hertz. En een minimumdrempel voor ionenselectie op 1.990 tellen.

Voor kwantitatieve analyse van single neuron RNA-modificatie door middel van massaspectrometrie, construeer kalibratiecurven met behulp van een geëxtraheerd ionchromatogram piekgebieden verkregen voor gemodificeerde nucleosidestandaarden bij een minimum van vijf concentraties om interpolatie van onbekende endogene analytconcentraties mogelijk te maken. Single neuron RNA modificatie analyse door massaspectrometrie omvat de handmatige isolatie van geïdentificeerde neuronen in kleine monstervolumes voor lysisvertering en LC-MS / MS-analyse. Single neuron RNA modificatie analyse door massaspectrometrie detecteerde routinematig meer dan een dozijn RNA-modificaties in enkele neuronen van het centrale zenuwstelsel van Aplysia californica, wat de dekking van bijna de helft van het bekende epitranscriptoom van dit dier in een enkele cel vertegenwoordigt.

De resultaten onthulden voor het eerst dat RNA-modificatieprofielen van afzonderlijke cellen konden afwijken van bulkcellen in hetzelfde weefsel. Verdere ondersteuning voor unieke gemodificeerde nucleosidepatronen werd verkregen van een afzonderlijk cohort van dieren waarin paarsgewijze vergelijkingen werden uitgevoerd voor 13 RNA-modificaties, gewoonlijk gedetecteerd in zowel de enkele neuronen als het bulkweefsel. RNA-modificaties in functioneel verschillende cellen vormden unieke clusters in de scoreplot, terwijl homologe R2 / LPl1-neuronen co-clusterden.

De laadplot laat zien dat de verschillen voornamelijk werden veroorzaakt door de overvloed aan positionele isomeren van methyladenosine, waaronder 2’O-methyladenosine en N1-methyladenosine. Externe kalibratiecurven werden gegenereerd voor N1-methyladenosine, pseudouridine, 2’O-methylguanosine, 2’O-methyladenosine en N6-dimethyladenosine. En de hoeveelheid van elk gemodificeerd nucleoside in de metacerebrale cellen en R2/LPl1-celparen werd bepaald door interpolatie.

Zorg ervoor dat een minimaal volume kunstmatig zeewater wordt overgebracht naar de PCR-buis samen met het enkele geïsoleerde neuron. Dit minimaliseert de verdunning van monsters, wat uiteindelijk van invloed is op de analytdetectie. Dit protocol kan worden gebruikt voor het onderzoeken van distributies van RNA-modificaties in subcellulaire structuren, zoals axonen en dendrieten, om het begrip van de mechanismen van activiteitsafhankelijke lokale translatie te verbeteren.