تتبع نسب الخلايا الجذعية المستحثة ذات العلامات الفلورية في دماغ الفأر البالغ

إن وضع علامة على الخلايا الجذعية وذريتها باستخدام خط فأر تتبع النسب المعدلة وراثيا القابل للحث يسمح بالتحليل المكاني والزماني للتنشيط والانتشار والهجرة و / أو التمايز بين الخلايا الجذعية البالغة في الدماغ في الجسم الحي. يمكن أن يكشف تتبع النسب عن معلومات جديدة حول الالتزام بالنسب ، والاستجابة للتدخلات ، والقوة المتعددة. تشمل مزايا نهج تتبع السلالات المعدلة وراثيا خصوصية تتبع سلالة خلية معينة ، والتعبير الذي لا يمحى عن البروتين الفلوري بغض النظر عن دوران الخلايا أو التمايز ، وانخفاض سمية الدوكسيسلين ، والتنشيط الشرطي ، وسهولة الاستخدام مع الفحوصات الشائعة في اتجاه المصب على أنسجة تتبع النسب بما في ذلك التلطيخ المناعي والتألق المناعي.

نظرا للتأثير الواسع النطاق للدونة والخلية في دماغ البالغين ، فإن توصيف وتحليل الخلايا الجذعية البالغة سيساعد في الإبلاغ عن دراسة الأمراض العصبية التنكسية ، والتأثيرات الأيضية على لدونة الدماغ ، والشيخوخة ، وغيرها من الحالات ذات الصلة. للبدء ، قم بتسخين الشرائح إلى درجة حرارة الغرفة وبعد الإصلاح باستخدام الأسيتون البارد المثلج لمدة 15 دقيقة. اغسل الشرائح لمدة خمس دقائق في مخزن مؤقت للشطف 1X ، مع الاهتزاز بمعدل 60 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة بين كل خطوة.

تخلل لوقوف المستضدات النووية مع 0.3٪ Triton X-100 لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. Permeabilize لوقوف المستضدات السيتوبلازمية مع 0.3 ٪ Tween-20 لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بإجراء استرجاع المستضد عن طريق شرائح الميكروويف في 50 إلى 100 ملليلتر من محلول استرجاع مستضد DAKO 1x على مستوى منخفض لمدة 10 دقائق ، مرتين.

بعد ذلك ، اشطف بالمخزن المؤقت لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. احتضان الشرائح في 0.3٪ Typogen Black في 70٪ من الإيثانول لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ثم اغسلها بمخزن مؤقت للشطف. ارسم حاجزا مسعورا حول الأنسجة.

كتلة لمدة 20 دقيقة في 37 درجة مئوية مع حجب كاشف. وتحضن مع الأجسام المضادة الأولية المخففة في الأجسام المضادة المخففة بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية. اغسل الشرائح لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.

في اليوم التالي ، احتضان الأقسام في الأجسام المضادة الثانوية Alexa Fluor لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم اغسل الشرائح مرتين في المخزن المؤقت للشطف لمدة 10 دقائق. قم بتغطية أقسام الدماغ في 100 ميكرولتر من واحد إلى 500 جسم مضاد مضاد ل GFP مقترن ب AlexaFluor 488 ، واحتضن بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية لتعزيز Fluor4 الداخلي ، ووضع علامة على الخلايا التي تم تتبعها.

في اليوم التالي ، اغسل بمخزن مؤقت للشطف مرتين. ثم يغسل في الماء DI الجاري لمدة خمس دقائق. Counterstain مع 100 نانوغرام لكل ملليلتر 4’6-diamidino-2-phenylindole لمدة خمس دقائق.

ثم يغسل في الماء DI الجاري لمدة خمس دقائق. أضف قطرة من وسط التركيب الآمن الفلورسنت فوق كل قسم من أقسام الأنسجة وأغلقها بغطاء 22 ملم × 22 ملم. يوصى بالتصوير في يوم التركيب لضمان الإشارة المثلى.

لبدء التثبيت والتقسيم بعد التروية عبر القلب بعد إصلاح الأدمغة في 4٪ PFA بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية. ثم مرة أخرى لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. اغسل الأدمغة في 1x PBS لمدة ساعة مرتين في درجة حرارة الغرفة.

قطع الدماغ إلى أقسام سميكة ملليمتر واحد باستخدام كتلة الدماغ السهمية ووضعها في خمسة ملليلتر أنابيب الطرد المركزي الصغيرة التي تحتوي على 1x PBS. بالنسبة للمعالجة المسبقة للميثانول ، ابدأ بالغسيل باستخدام 1x PBS لمدة ساعة واحدة مرتين في درجة حرارة الغرفة. يغسل في 50٪ الميثانول لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

يغسل في 80٪ من الميثانول لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. يغسل في الميثانول 100٪ لمدة ساعة واحدة ، مرتين ، في درجة حرارة الغرفة. عينات التبييض مع 5٪ بيروكسيد الهيدروجين في 20٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد والميثانول عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها.

بعد التبييض ، اغسل العينات في الميثانول لمدة ساعة واحدة مرتين في درجة حرارة الغرفة. يغسل في 20٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد والميثانول لمدة ساعة واحدة مرتين في درجة حرارة الغرفة. يغسل في 80٪ من الميثانول لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

يغسل في 50٪ الميثانول لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. يغسل في PBS لمدة ساعة واحدة مرتين في درجة حرارة الغرفة. يغسل في PBS 0.2٪ Triton X-100 لمدة ساعة واحدة مرتين في درجة حرارة الغرفة.

بالنسبة للبقع المناعية لتطهير الأدمغة ، ابدأ باحتضان العينات في 1x PBS ، 0.2٪ Triton X-100 ، 20٪ DMSO ، 0.3 glycine molar ، عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها على شاكر مداري. كتلة في 1x PBS ، 0.2 ٪ Triton X-100 ، 10 ٪ DMSO ، 6 ٪ مصل الماعز عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاثة أيام على شاكر مداري. اغسل العينات في 1x PBS ، 0.2٪ Tween-20 ، 10 ميكروغرام لكل ملليلتر من ملح الصوديوم الهيبارين من الغشاء المخاطي للخنزير لمدة ساعة واحدة مرتين عند 37 درجة مئوية.

بعد ذلك ، احتضان في 1x PBS ، 0.2 ٪ Tween-20 ، 10 ميكروغرام لكل ملليلتر الهيبارين ، 5 ٪ DMSO ، 3 ٪ مصل الماعز الذي يحتوي على تركيز واحد إلى 500 من الأرانب المضادة GFP AlexaFluor 488 عند 37 درجة مئوية على شاكر مداري لمدة يومين. اغسل العينات في 1x PBS ، 0.2٪ Tween-20 مع 10 ميكروغرام لكل ملليلتر من الهيبارين لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية على شاكر مداري ثلاث مرات ثم مرة واحدة في اليوم لمدة يومين. احتضان العينات بين عشية وضحاها في ملليلتر واحد من 50٪ Tetrahydrofuran والماء.

احتضان العينات لمدة ساعة واحدة في ملليلتر واحد من 80٪ THF Tetrahydrofuran والماء. احتضان العينات مرتين لمدة ساعة واحدة في 100٪ Tetrahydrofuran. جفف العينات بمنديل معقم واحتضنها في ثنائي كلورو الميثان حتى تغرق في قاع القارورة.

لا تحضن لأكثر من 60 دقيقة. احتضان العينات في ملليلتر واحد من ثنائي بنزيل الأثير حتى تصبح واضحة. تخزين العينات في ثنائي البنزيل الأثير في درجة حرارة الغرفة حتى تصبح جاهزة للتصوير.

لتصوير أقسام الدماغ الملطخة بالمناعة، قم بتحليل الشرائح عبر المجهر البؤري، حيث يمكن تأكيد التعبير المشترك عن الأجسام المضادة المتعددة. نحن نستخدم مجهر Leica Stellaris خمسة مع كاشفات HyD S الهجينة. لتصوير الأدمغة التي تم تطهيرها ، استخدم مجهرا بؤريا مقلوبا مع مرحلة آلية ووظيفة تبليط آلية.

ابدأ بوضع قسم دماغي مسطح على طبق زجاجي سفلي في المغمورة في إيثر ثنائي البنزيل. لوحظ اختلاف ملحوظ في كثافة الفلورسنت عبر مناطق مختلفة من الدماغ وأنواع مختلفة من الخلايا بعد فترة مطاردة النبض في السلالات التي تتبعت الأدمغة. كان للخلايا الظهارية المشيمية في الضفيرة المشيمية غشاء خلية سميك وإشارة فلورسنت خضراء قوية تشير إلى أنها مشتقة من خلايا تيرت الإيجابية التي يمكن تمييزها بسهولة عن الخلايا المحيطة.

كانت أنواع الخلايا الأصغر الأخرى في سدى الضفيرة المشيمية تحتوي على إشارة GFP أضعف. في المخيخ ، عبرت الخلايا الدبقية Bergmann عن مستويات أعلى من GFP من خلايا السلة ، كما كان هناك اختلاف في تعبير GFP بين خلايا السلة الفردية. بالنسبة للمحاور العصبية الحسية للمصنع داخل الطبقة الكبيبية للمصباح الشمي ، عبرت أيضا عن مستويات عالية من محاور الخلايا العصبية الحسية GFP الشمية التي تملأ الطبقة الكبيبية من المصباح الشمي عبرت عن مستويات عالية من الطماطم الغشائية ، أو التألق الأحمر عند مقارنتها بمعظم مناطق الدماغ الأخرى حتى عندما تكون نفس الخلايا العصبية إيجابية GFP مما يشير إلى أن بعض الخلايا يبدو أنها تفقد إشارة الطماطم ببطء أكبر أثناء تتبع الأنساب.

في المقابل ، في الضفيرة المشيمية GFP عبرت الخلايا الإيجابية عن الطماطم المنخفضة. في معظم مناطق الدماغ الأخرى ، يتم التعبير عن إشارات الطماطم بمستوى منخفض عبر معظم أنواع الخلايا مع الخلايا البطانية كونها بعض الخلايا الوحيدة التي كانت إشارة الفلورسنت ساطعة بما يكفي لتبرز بشكل واضح من خلفية الفلورسنت الحمراء لأنسجة المخ. أهم شيء يجب تذكره هو أن إشارة الفلورسنت في الأدمغة التي تم تطهيرها تتلاشى بشكل أسرع من معظم الفحوصات المناعية الأخرى.

تذكر أن تصور عيناتك في أقرب وقت ممكن وفي غضون سبعة أيام. بعد ذلك ، يمكن إجراء تصوير شرائح الدماغ أو الأدمغة الواضحة ، وتلوين العلامات بإشارات GFP وقياسنا الكمي ل Fluorence باستخدام برامج برمجية.