Bioengineering
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Vernetzte makroporöse 3D-Gerüste aus Mikrogelstäben
Chapters
Summary June 16th, 2022
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Mikrogelstäbchen mit komplementären reaktiven Gruppen werden durch Mikrofluidik mit der Fähigkeit hergestellt, sich in wässriger Lösung zu vernetzen. Die anisometrischen Mikrogele klemmen und verbinden sich zu stabilen Konstrukten mit größeren Poren im Vergleich zu sphärischen Systemen. Mit GRGDS-PC modifizierte Mikrogele bilden makroporöse 3D-Konstrukte, die für die Zellkultur verwendet werden können.
Transcript
Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von Mikrogelstäben, die sich zu Mikroporengerüsten verbinden. Diese Gerüste können in Kombination mit Zellen verwendet werden, die den erforderlichen Raum für eine effiziente Zellzellinteraktion bieten. Die beiden verschiedenen Arten von Mikro-Gel-Stäbchen verbinden sich bei Kontakt.
Das hohe Aspektverhältnis führt zu größeren Poren bei gleichzeitiger Beibehaltung der Gerüststabilität mit weniger synthetischem Material im Vergleich zu sphärischen Mikrogelen. Mikroporengerüste würden die Infiltration und Interaktion endogener Zellen zur Reparatur von geschädigtem Gewebe erheblich verbessern. Die großen Poren erleichtern die Bildung von Blutgefäßen, um Nährstoffe an das wachsende Gewebe auszutauschen.
Die Reduzierung von Gerüstmaterial ist vorteilhaft, da mehr Freiräume für die Gewebebildung vorgesehen sind, was sowohl für In-vitro- als auch für In-vivo-Anwendungen wichtig ist. Ein kritischer Aspekt ist die mikrofitische Chipulationstechnik. Um eine kontinuierliche Produktion von Mikrogelstäben zu gewährleisten, muss das Produkt effektiv und verstopfungsfrei aus dem Rohr transportiert werden.
Führen Sie zunächst die Nadeln in die Polyethylenröhrchen ein und entfernen Sie das Gas aus der Spritze und dem Röhrchen. Führen Sie dann ein zusätzliches Polyethylenrohr in den Auslass für die Produktsammlung ein. Als nächstes legen Sie alle Glasspritzen und die Spritzenpumpen ein und führen jedes Schlauchende in den entsprechenden Einlass ein.
Dann fokussieren Sie das Mikroskop auf den Ölwasserquerschnitt. Starten Sie die erste Ölspritzenpumpe, um den Kanal zuerst mit Öl zu füllen, um eine Kanalbenetzung durch die dispergierte Phase zu verhindern. Verringern Sie dann die erste Öldurchflussrate auf 30 Mikroliter pro Stunde und starten Sie die Prepolymer-Spritzenpumpe, bis die dispergierte wässrige Phase am Querschnitt beobachtet werden kann.
Als nächstes stellen Sie die Prepolymer-Durchflussrate auf 30 Mikroliter pro Stunde ein und fokussieren das Mikroskop auf den Ausgang. Starten Sie dann die zweite Ölspritzenpumpe und warten Sie, bis das Strömungsregime stabil ist. Legen Sie das Auslassrohr in einen Auffangbehälter und stellen Sie das UV-Bestrahlungssystem so ein, dass die Bestrahlungsstärke im Bereich von 900 bis 1000 Milliwatt pro Quadratzentimeter liegt.
Und der Bestrahlungsfleck ist der gerade Kanalteil vor dem Auslass. Stellen Sie vor der UV-Bestrahlung die Durchflussraten des Prepolymers und des ersten Öls ein, um das gewünschte Aspektverhältnis im Bereich von 3,0 bis 4,5 zu erreichen, und stellen Sie die Bestrahlungszeit der dispergierten Phase auf etwa 2,3 Sekunden ein, abhängig von der Größe des Bestrahlungsflecks. Starten Sie dann die UV-Bestrahlung und stellen Sie gegebenenfalls die Durchflussmengen gemäß dem vorherigen Unterabschnitt erneut ein.
Ändern Sie als Nächstes den Sammelbehälter und notieren Sie sich die Startzeit und die Durchflussraten der Produktsammlung. Um die Sammlung zu beenden, entfernen Sie den Sammlungscontainer und notieren Sie sich die Uhrzeit. Danach stoppen Sie die Bestrahlung und alle Spritzenpumpen.
Anschließend wird das Produkt jeweils fünfmal mit n-Hexan, Isopropanol und entionisiertem Wasser gewaschen. Entfernen Sie dann den Überstand nach der Stäbchensedimentation. Die Dispersion der ersten Komponente wird in ein konisches 1,5- oder Zwei-Milliliter-Durchstechflasche überführt.
Anschließend wird die zweite Komponente kontrolliert im Dauerbetrieb mit einer 100-Mikroliter-Pipette zugegeben und der Inhalt direkt mit der Pipette zur Flüssigkeitsaufnahme gemischt und wieder zugegeben. Dann fügen Sie G R G D S P C Lösung zu der vernetzten Struktur hinzu, um alle verbleibenden Epoxidgruppen mit dem Zelladhäsivpeptid zu modifizieren, das ein freies Amin und Thyal trägt, und lassen Sie es über Nacht bei Raumtemperatur stehen. Als nächstes entfernen Sie die nicht reagierten Moleküle durch Waschen mit entionisiertem Wasser und entfernen den Überstand.
Nachdem Sie den Wasserspiegel gesenkt haben, öffnen Sie die Durchstechflasche und entstrahlen Sie sie mit UV-Licht der Wellenlänge von 250 bis 300 Nanometern. Verschließen Sie dann die Durchstechflasche und legen Sie die Durchstechflasche auf eine saubere Bank. Danach mit sterilem Wasser waschen.
Ersetzen Sie das Wasser in der Durchstechflasche durch Zellkulturmedien und lassen Sie das Gleichgewicht fünf Minuten lang einwirken. Als nächstes übertragen Sie das makroporöse Gerüst in eine Zellkulturplatte für das Experiment, indem Sie gießen oder einen Spatel verwenden. Die konfokale Mikroskopie zeigte, dass das poröse 3D-Makrokonstrukt aus miteinander verbundenen Amin- und Epoxid-funktionalisierten Mikrogelstäbchen bestand.
Das Konstrukt weist eine kompakte Geometrie von etwa 10.000 Mikrogelstäbchen auf, die innerhalb von zwei bis drei Sekunden gebildet werden. Der effektive Elastizitätsmodul von Amin- und Epoxid-Mikrogel-Stäbchen sowie Amin- und Epoxid-Mikrogelkugeln wird durch Nanoeindringung gemessen. Um aktive funktionelle Gruppen nachzuweisen, kann Fluorescein-Isothiocyanat verwendet werden, um primäre Aminogruppen sichtbar zu machen, und Fluoresceinamin-Isomer kann verwendet werden, um Epoxidgruppen zu markieren.
Die Amin-Mikro-Gelstäbchen haben Abmessungen mit einer durchschnittlichen Länge von 553 Mikrometern und einer durchschnittlichen Breite von 193 Mikrometern in entionisiertem Wasser, was zu einem Aspektverhältnis von etwa 3,0 führt. Die Mittelwerte der Makroporen und der aus Mikrogelstäben zusammengesetzten Gerüste betragen 100 Mikrometer, wobei 90% der Porengrößen von 30 Mikrometern bis über 150 Mikrometer reichen. Die kugelartigen Mikrogele ergeben Cluster mit Porengrößen zwischen etwa 10 und 55 Mikrometern, mit einem Mittelwert von etwa 22 Mikrometern.
Die beschriebenen Mikrogelstäbe sind ausgebildet, um durch zufälliges Mischen miteinander verbundene Mikroporengerüste herzustellen. Ein kontrolliertes Mischverfahren könnte in Zukunft die Herstellung maßgeschneiderter Gerüstgeometrien ermöglichen. Die Steifigkeit der Mikrogele und die biochemischen Hinweise können je nach Verkaufsanforderungen variiert werden.
Durch die Kombination verschiedener Bausteine können unterschiedlichste Geometrien und Eigenschaften innerhalb eines Gerüsts erreicht werden. Auf diese Weise können wir bestimmte Zellen effizient angreifen, um mehrzelliges Gewebe zu bilden.
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