Cancer Research
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使用造血细胞因子接种肿瘤的实验性黑色素瘤免疫治疗模型
Chapters
Summary February 24th, 2023
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该协议提出了一种癌症免疫治疗模型，使用表达Flt3L的B16-F10黑色素瘤进行基于细胞的肿瘤疫苗接种。该协议演示了程序，包括培养的肿瘤细胞的制备，肿瘤植入，细胞照射，肿瘤生长的测量，肿瘤内免疫细胞的分离和流式细胞术分析。
Transcript
该方案提供了临床实体瘤免疫治疗模型和研究平台，研究肿瘤细胞与浸润免疫细胞之间的关系。这种基于细胞的肿瘤疫苗方便，使用简单，并且可以与其他治疗方式（如检查点阻断）结合使用，以实现加法或协同效应，从而产生更有效和高的肿瘤免疫力。帮助演示该程序的是我实验室的研究技术员Ann Balancio。
首先，在IMDM中培养B16-F10黑色素瘤细胞，含有10%的热非活性FBS，2毫摩尔谷氨酰胺，1毫摩尔丙酮酸钠，1毫摩尔MEM非必需氨基酸和青霉素和链霉素每毫升100单位。用5%二氧化碳将细胞系保持在37摄氏度。按照文本手稿中的说明播种和收获 B16-F10 细胞。
取出培养基并用PBS洗涤烧瓶一次。吸出PBS并加入5毫升0.25%胰蛋白酶-EDTA，然后用力敲击培养瓶的边缘。加入15毫升培养基以中和胰蛋白酶-EDTA，并将烧瓶的内容物倒入50毫升离心管中。
用10毫升PBS清洗培养皿表面，然后倒入相同的50毫升离心管中。将细胞在 200 RCF 下离心 5 分钟。弃去上清液，用手指敲击管底部破碎细胞沉淀。
加入冷的10毫升PBS，轻轻移液细胞悬液。然后，使用血细胞计数器手动计数细胞。注射前将细胞放在冰上。
使用30号针在左胁的50微升冷PBS中皮内植入50，000个细胞B16-F10肿瘤细胞。植入的B16-F10肿瘤细胞的剂量可能需要在50，000至500，000个细胞的范围内进行调整，以成功发展肿瘤。实施后，使用电子数字卡尺每周测量肿瘤长度和宽度三次。
计算肿瘤体积，当肿瘤达到文本手稿中所述的两毫米大小时，用肿瘤疫苗治疗小鼠。使用设置为160千伏和25毫安的X射线辐照器，以150灰剂量的伽马射线照射细胞。注射前通过台盼蓝染色计数并检查细胞活力。
在与原始肿瘤植入相同的侧翼的50微升冷PBS中皮内注射100万个辐照的B16-Flt3L细胞。在初始细胞植入后的第 3、6 和 9 天距离原发肿瘤部位约 1 厘米。用彩色笔标记疫苗注射部位，以将其与原发肿瘤区分开来。
如果最初植入50， 000个B16-F10细胞，建议在第8，11和14天进行疫苗治疗。从每只安乐死小鼠中手术切除带有皮肤的肿瘤，并将其放入装有1毫升10%FBS RPMI 1640培养基的24孔板中。在两毫升消化缓冲液中将肿瘤切成小块，并在37摄氏度下孵育25分钟。
加入10毫升10%FBS RPMI 1640培养基以停止消化。使用25毫升血清移液管将细胞转移到40微米细胞过滤器中。然后使用一毫升注射器的柱塞研磨组织。
在 500 RCF 下将细胞在 4 摄氏度下离心 5 分钟。将沉淀重悬于5毫升40%密度梯度特定培养基中的PBS稀释至1x浓度。将细胞悬液缓慢加入5毫升含有PBS的80%密度梯度特定培养基上。
在室温下以低制动设置以 325 RCF 离心至细胞 23 分钟。离心后，小心地收集在40%和80%密度梯度特定培养基之间的界面处的白细胞层，并将其通过40微米的细胞过滤器。在 500 RCF 下将细胞在 4 摄氏度下离心 5 分钟。
将沉淀在两毫升红细胞裂解缓冲液中在室温下孵育五分钟。孵育后，加入10毫升10%FBS RPMI 1640培养基以淬灭RBC裂解缓冲液。在 400 RCF 下将细胞在 4 摄氏度下离心 5 分钟。
将细胞重悬于0.5毫升10%FBS RPMI 1640培养基中，并在使用前计算细胞总数以进行进一步分析。通过流式细胞术分析收集脾脏或引流淋巴结作为免疫细胞亚群门控策略的对照。遵循文本手稿中描述的细胞隔离方法。
植入的B16-F10细胞的可见黑点通常在肿瘤植入后约三天在皮肤表面上观察到。在肿瘤结节达到或超过两毫米大小后三天，六天和九天用肿瘤疫苗治疗小鼠。在肿瘤植入后约两周，在接种疫苗的小鼠组中观察到显着的肿瘤生长减少。
从白细胞层收集的细胞含有许多肿瘤细胞，因此很难轻易定义淋巴细胞群。因此，在流式细胞术分析中，脾细胞被并行用于肿瘤内免疫细胞亚群的适当设门。将CD103阳性、CD11C阳性DC、CD8阳性、CD4阳性和Treg的门控策略与补偿矩阵一起绘制。
还提供了所获得账户的代表性数据和每个人口的频率。来自接种疫苗的小鼠的肿瘤内CD103阳性，CD11C阳性DC显示共刺激配体CD86的表达显着升高。接种疫苗的小鼠还显示肿瘤浸润CD8阳性和CD4阳性，Foxp3阴性细胞以及CD8阳性颗粒酶B阳性和干扰素γ阳性CTL增加。
原发肿瘤和肿瘤疫苗之间保持足够的距离。这种物理分离对于避免两个肿瘤植入物之间的潜在融合至关重要。
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