Cancer Research
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Eksperimentel melanom immunterapi model ved hjælp af tumorvaccination med et hæmatopoietisk cytokin
Chapters
Summary February 24th, 2023
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Protokollen præsenterer en kræftimmunterapimodel ved hjælp af cellebaseret tumorvaccination med Flt3L-ekspressive B16-F10 melanom. Denne protokol demonstrerer procedurerne, herunder forberedelse af dyrkede tumorceller, tumorimplantation, cellebestråling, måling af tumorvækst, isolering af intratumorale immunceller og flowcytometrianalyse.
Transcript
Denne protokol giver klinisk solid tumorimmunterapi model og en forskningsplatform til at studere forholdet mellem tumorceller og infiltrerende immunceller. Denne cellebaserede tumorvaccine er praktisk, ligetil at bruge og kan kombineres med andre terapeutiske modaliteter såsom checkpoint-blokade for at opnå additiv eller synergistisk effekt, der kan resultere i mere potent og høj tumorimmunitet. Med til at demonstrere proceduren vil være Ann Balancio, en forskningstekniker fra mit laboratorium.
Til at begynde med dyrkes B16-F10 melanomceller i IMDM, der indeholder 10% varme inaktiv FBS, 2 millimolar glutamin, 1 millimolar natriumpyruvat, 1 millimolar MEM ikke-essentielle aminosyrer og 100 enheder pr. milliliter hver af penicillin og streptomycin. Oprethold cellelinjen ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid. Frø og høst B16-F10-cellerne som beskrevet i tekstmanuskriptet.
Fjern dyrkningsmediet, og vask kolberne én gang med PBS. Aspirer PBS og tilsæt 5 ml 0,25% trypsin-EDTA, efterfulgt af hårdt at banke på kanten af kulturkolben. Tilsæt 15 ml kulturmedium for at neutralisere trypsin-EDTA og hæld indholdet af kolben i et 50 ml centrifugerør.
Vask opvaskeoverfladen med 10 ml PBS og hæld i det samme 50 ml centrifugerør. Centrifuger cellerne i 5 minutter ved 200 RCF. Kassér supernatanten og bryd cellepelleten ved at fingerklikke på bunden af røret.
Tilsæt kolde 10 ml PBS og pipetter forsigtigt cellesuspensionen. Tæl derefter cellerne manuelt ved hjælp af et hæmocytometer. Hold cellerne på is før injektion.
Intradermalt implantat 500.000 celler B16-F10 tumorceller i 50 mikroliter kold PBS i venstre flanke ved hjælp af en 30 gauge nål. Dosis af implanterede B16-F10 tumorceller skal muligvis justeres i et interval på 50.000 til 500.000 celler for en vellykket tumorudvikling. Efter implementering måles tumorlængden og bredden tre gange om ugen ved hjælp af en elektronisk digital tykkelse.
Beregn tumorvolumen og behandl musene med tumorvaccine, når tumorer har nået en størrelse på to millimeter som beskrevet i tekstmanuskriptet. Ved hjælp af en røntgenbestråler indstillet til 160 kilovolt og 25 milliampere, bestråle celler ved 150 grå doser gammastråler. Tæl og kontroller cellens levedygtighed ved trypanblå farvning før injektion.
Intradermalt injicere musene med 1 million bestrålede B16-Flt3L-celler i 50 mikroliter kold PBS på samme flanke som den oprindelige tumorimplantation. Ca. en centimeter fra stedet for den primære tumor på dag 3, 6 og 9 efter den første celleimplantation. Marker vaccineinjektionsstederne med en farvet pen for at skelne dem fra den primære tumor.
Hvis 50.000 B16-F10-celler oprindeligt blev implanteret, anbefales det at udføre vaccinebehandling på dag 8, 11 og 14. Kirurgisk fjernede tumoren med huden fra hver aflivet mus og satte den i en 24 brøndplade med 1 milliliter 10% FBS RPMI 1640 medium. Skær tumorerne i små stykker i to milliliter fordøjelsesbuffer og inkuber i 25 minutter ved 37 grader Celsius.
Tilsæt 10 ml 10% FBS RPMI 1640 medium for at stoppe fordøjelsen. Overfør cellerne til en 40 mikrometer cellesi ved hjælp af en 25 ml serologisk pipette. Brug derefter stemplet på en en milliliter sprøjte til at male vævene.
Centrifuge cellerne ved 500 RCF i 5 minutter ved 4 grader Celsius. Pelleten resuspenderes i 5 ml 40% densitetsgradientspecifikt medium i PBS fortyndet til 1x koncentration. Cellesuspensionen tilsættes langsomt oven på 5 ml 80% densitetsgradientspecifikt medium indeholdende PBS.
Centrifuge til cellerne ved 325 RCF med en lav bremseindstilling i 23 minutter ved stuetemperatur. Efter centrifugering opsamles leukocytlaget forsigtigt ved grænsefladen mellem 40% og 80% densitetsgradientspecifikt medium og føres gennem en 40 mikrometer cellesi. Centrifuge cellerne ved 500 RCF i 5 minutter ved 4 grader Celsius.
Inkuber pelleten i to milliliter lysisbuffer for røde blodlegemer i fem minutter ved stuetemperatur. Efter inkubation tilsættes 10 ml 10% FBS RPMI 1640 medium for at slukke RBC-lysisbufferen. Centrifuge cellerne ved 400 RCF i 5 minutter ved 4 grader Celsius.
Resuspender cellerne i 0,5 ml 10% FBS RPMI 1640 medium, og tæl det samlede antal celler før brug til yderligere analyse. Saml milten eller de drænende lymfeknuder som kontroller for gatingstrategien for immuncelleundergrupper ved flowcytometrianalyse. Følg celleisoleringsmetoden beskrevet i tekstmanuskriptet.
En synlig sort prik af de implanterede B16-F10-celler blev normalt observeret på hudoverfladen ca. tre dage efter tumorimplantation. Mus blev behandlet med en tumorvaccine tre, seks og ni dage efter, at tumorknuden havde nået eller overskredet størrelsen på to millimeter. En signifikant tumorvækstreduktion blev observeret i den vaccinerede musgruppe ca. to uger efter tumorimplantation.
Celler indsamlet fra leukocytlaget indeholdt mange tumorceller, hvilket gjorde det vanskeligt at let definere lymfocytpopulationen. Derfor blev splenocyt anvendt parallelt til korrekt gating af intratumorale immuncelleundergrupper i flowcytometrianalyse. Gating-strategierne for CD103-positive, CD11C-positive DC, CD8-positive, CD4-positive og Treg blev plottet sammen med kompensationsmatrixen.
Repræsentative data om erhvervede konti og hyppighed af hver befolkning blev også leveret. Intratumoral CD103-positiv, CD11C-positiv DC fra vaccinerede mus, viste en signifikant forhøjet ekspression af den co-stimulerende ligand CD86. Vaccinerede mus viste også en stigning i tumorinfiltrerende CD8-positive og CD4-positive, Foxp3-negative celler såvel som i CD8-positive granzyme B-positive og interferon gamma-positive CTL'er.
Hold en tilstrækkelig afstand mellem den primære tumor og tumorvaccinen. Denne fysiske adskillelse er afgørende for at undgå potentiel fusion mellem de to tumorimplantater.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
