Cancer Research
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हेमटोपोइएटिक साइटोकिन के साथ ट्यूमर टीकाकरण का उपयोग करके प्रयोगात्मक मेलेनोमा इम्यूनोथेरेपी मॉडल
Chapters
Summary February 24th, 2023
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प्रोटोकॉल एफएलटी 3 एल-व्यक्त बी 16-एफ 10 मेलेनोमा के साथ सेल-आधारित ट्यूमर टीकाकरण का उपयोग करके एक कैंसर इम्यूनोथेरेपी मॉडल प्रस्तुत करता है। यह प्रोटोकॉल प्रक्रियाओं को प्रदर्शित करता है, जिसमें सुसंस्कृत ट्यूमर कोशिकाओं की तैयारी, ट्यूमर प्रत्यारोपण, सेल विकिरण, ट्यूमर के विकास का माप, इंट्राट्यूमरल प्रतिरक्षा कोशिकाओं का अलगाव और फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण शामिल हैं।
Transcript
यह प्रोटोकॉल नैदानिक ठोस ट्यूमर इम्यूनोथेरेपी मॉडल और ट्यूमर कोशिकाओं और घुसपैठ प्रतिरक्षा कोशिकाओं के बीच संबंधों का अध्ययन करने के लिए एक शोध मंच प्रदान करता है। यह सेल-आधारित ट्यूमर वैक्सीन सुविधाजनक है, उपयोग करने के लिए सरल है, और इसे अन्य चिकित्सीय तौर-तरीकों जैसे चेकपॉइंट नाकाबंदी के साथ जोड़ा जा सकता है, ताकि योजक या सहक्रियात्मक प्रभाव प्राप्त किया जा सके जिसके परिणामस्वरूप अधिक शक्तिशाली और उच्च ट्यूमर प्रतिरक्षा हो सकती है। प्रक्रिया को प्रदर्शित करने में मदद करने के लिए एन बैलेंसियो, मेरी प्रयोगशाला से एक शोध तकनीशियन होगा।
शुरू करने के लिए, आईएमडीएम में बी 16-एफ 10 मेलेनोमा कोशिकाओं को कल्चर करें, जिसमें 10% गर्मी निष्क्रिय एफबीएस, 2 मिलीमोलर ग्लूटामाइन, 1 मिलीमोलर सोडियम पाइरूवेट, 1 मिलीमोलर एमईएम गैर-आवश्यक अमीनो एसिड और पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन की 100 इकाइयां प्रति मिलीलीटर होती हैं। 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ सेल लाइन को 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें। बी 16-एफ 10 कोशिकाओं को बीज और कटाई जैसा कि पाठ पांडुलिपि में वर्णित है।
संस्कृति माध्यम को हटा दें और फ्लास्क को एक बार पीबीएस के साथ धो लें। एस्पिरेटेड पीबीएस और 0.25% ट्रिप्सिन-ईडीटीए के 5 मिलीलीटर जोड़ें, इसके बाद कल्चर फ्लास्क के रिम को कठोरता से टैप करें। ट्रिप्सिन-ईडीटीए को बेअसर करने के लिए 15 मिलीलीटर कल्चर माध्यम जोड़ें और फ्लास्क की सामग्री को 50 मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में डालें।
डिश की सतह को 10 मिलीलीटर पीबीएस के साथ धोएं और उसी 50 मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में डालें। 200 आरसीएफ पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें और ट्यूब के निचले हिस्से को उंगली से टैप करके सेल पेलेट को तोड़ दें।
ठंडा 10 मिलीलीटर पीबीएस जोड़ें और धीरे से सेल निलंबन को पिपेट करें। फिर, हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं को मैन्युअल रूप से गिनें। इंजेक्शन से पहले कोशिकाओं को बर्फ पर रखें।
इंट्राडर्मल रूप से 30 गेज सुई का उपयोग करके बाएं फ्लैंक में ठंडे पीबीएस के 50 माइक्रोलीटर में 500,000 कोशिकाओं बी 16-एफ 10 ट्यूमर कोशिकाओं को प्रत्यारोपित करें। प्रत्यारोपित बी 16-एफ 10 ट्यूमर कोशिकाओं की खुराक को सफल ट्यूमर विकास के लिए 50, 000 से 500, 000 कोशिकाओं की सीमा में समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है। कार्यान्वयन के बाद, इलेक्ट्रॉनिक डिजिटल कैलिपर का उपयोग करके सप्ताह में तीन बार ट्यूमर की लंबाई और चौड़ाई को मापें।
ट्यूमर की मात्रा की गणना करें और ट्यूमर वैक्सीन के साथ चूहों का इलाज करें जब ट्यूमर पाठ पांडुलिपि में वर्णित दो मिलीमीटर के आकार तक पहुंच गए हैं। 160 किलोवोल्ट और 25 मिलीमीटर पर सेट एक्स-रे इरेडिएटर का उपयोग करके, गामा किरणों की 150 ग्रे खुराक पर विकिरणित कोशिकाएं। इंजेक्शन से पहले ट्रिपैन ब्लू स्टेनिंग द्वारा सेल व्यवहार्यता की गणना और जांच करें।
इंट्राडर्मल रूप से चूहों को मूल ट्यूमर आरोपण के समान फ्लैंक पर ठंडे पीबीएस के 50 माइक्रोलीटर में 1 मिलियन विकिरणित बी 16-एफएलटी 3 एल कोशिकाओं के साथ इंजेक्ट किया जाता है। प्रारंभिक सेल आरोपण के बाद 3, 6 और 9 दिनों में प्राथमिक ट्यूमर की साइट से लगभग एक सेंटीमीटर। वैक्सीन इंजेक्शन साइटों को प्राथमिक ट्यूमर से अलग करने के लिए एक रंगीन पेन के साथ चिह्नित करें।
यदि 50,000 बी 16-एफ 10 कोशिकाओं को शुरू में प्रत्यारोपित किया गया था, तो 8, 11 और 14 दिनों में टीका उपचार करने की सिफारिश की जाती है। शल्य चिकित्सा द्वारा प्रत्येक इच्छामृत्यु माउस से त्वचा के साथ ट्यूमर को हटा दिया गया और इसे 10% एफबीएस आरपीएमआई 1640 माध्यम के 1 मिलीलीटर के साथ 24 अच्छी प्लेट में डाल दिया गया। ट्यूमर को दो मिलीलीटर पाचन बफर में छोटे टुकड़ों में काट लें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 25 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
पाचन को रोकने के लिए 10% एफबीएस आरपीएमआई 1640 माध्यम के 10 मिलीलीटर जोड़ें। कोशिकाओं को 25 मिलीलीटर सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके 40 माइक्रोमीटर सेल स्ट्रेनर में स्थानांतरित करें। फिर ऊतकों को पीसने के लिए एक मिलीलीटर सिरिंज के प्लंजर का उपयोग करें।
कोशिकाओं को 500 आरसीएफ पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें। पीबीएस में 40% घनत्व ढाल विशिष्ट माध्यम के 5 मिलीलीटर में गोली को 1x सांद्रता तक पतला किया जाता है। पीबीएस युक्त 80% घनत्व ढाल विशिष्ट माध्यम के 5 मिलीलीटर के शीर्ष पर सेल निलंबन धीरे-धीरे जोड़ें।
कमरे के तापमान पर 23 मिनट के लिए कम ब्रेक सेटिंग के साथ 325 आरसीएफ पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, 40% और 80% घनत्व ढाल विशिष्ट माध्यम के बीच इंटरफ़ेस पर ल्यूकोसाइट्स परत को सावधानीपूर्वक एकत्र करें, और इसे 40 माइक्रोमीटर सेल स्ट्रेनर के माध्यम से पारित करें। कोशिकाओं को 500 आरसीएफ पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें।
कमरे के तापमान पर पांच मिनट के लिए लाल रक्त कोशिका लाइसिस बफर के दो मिलीलीटर में गोली को इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन बाद, आरबीसी लाइसिस बफर को बुझाने के लिए 10% एफबीएस आरपीएमआई 1640 माध्यम के 10 मिलीलीटर जोड़ें। 400 आरसीएफ पर कोशिकाओं को 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें।
कोशिकाओं को 10% एफबीएस आरपीएमआई 1640 माध्यम के 0.5 मिलीलीटर में पुन: निलंबित करें, और आगे के विश्लेषण के लिए उपयोग करने से पहले कोशिकाओं की कुल संख्या की गणना करें। प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण द्वारा प्रतिरक्षा कोशिका उपसमुच्चय की गेटिंग रणनीति के लिए नियंत्रण के रूप में प्लीहा या ड्रेनिंग लिम्फ नोड्स एकत्र करें। पाठ पांडुलिपि में वर्णित सेल अलगाव विधि का पालन करें।
प्रत्यारोपित बी 16-एफ 10 कोशिकाओं का एक दृश्यमान काला बिंदु आमतौर पर ट्यूमर प्रत्यारोपण के लगभग तीन दिन बाद त्वचा की सतह पर देखा गया था। ट्यूमर नोड्यूल के दो मिलीमीटर के आकार तक पहुंचने या उससे अधिक होने के तीन, छह और नौ दिन बाद चूहों को ट्यूमर वैक्सीन के साथ इलाज किया गया था। ट्यूमर प्रत्यारोपण के लगभग दो सप्ताह बाद टीकाकरण वाले चूहों के समूह में एक महत्वपूर्ण ट्यूमर वृद्धि में कमी देखी गई।
ल्यूकोसाइट्स परत से एकत्रित कोशिकाओं में कई ट्यूमर कोशिकाएं होती हैं, जिससे लिम्फोसाइट आबादी को आसानी से परिभाषित करना मुश्किल हो जाता है। इसलिए, फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण में इंट्राट्यूमरल प्रतिरक्षा कोशिका उपसमुच्चय के उचित गेटिंग के लिए समानांतर में स्प्लेनोसाइट का उपयोग किया गया था। सीडी 103 पॉजिटिव, सीडी 11 सी पॉजिटिव डीसी, सीडी 8 पॉजिटिव, सीडी 4 पॉजिटिव और ट्रेग की गेटिंग रणनीतियों को मुआवजा मैट्रिक्स के साथ प्लॉट किया गया था।
अधिग्रहित खातों और प्रत्येक आबादी की आवृत्ति का प्रतिनिधि डेटा भी प्रदान किया गया था। टीकाकरण किए गए चूहों से इंट्राट्यूमरल सीडी 103 पॉजिटिव, सीडी 11 सी पॉजिटिव डीसी ने सह-उत्तेजक लिगैंड सीडी 86 की काफी ऊंची अभिव्यक्ति प्रदर्शित की। टीका लगाए गए चूहों ने सीडी 8 पॉजिटिव और सीडी 4 पॉजिटिव, फॉक्सपी 3 नकारात्मक कोशिकाओं के साथ-साथ सीडी 8 पॉजिटिव ग्रैनजाइम बी पॉजिटिव और इंटरफेरॉन गामा पॉजिटिव सीटीएल में ट्यूमर घुसपैठ में वृद्धि भी प्रदर्शित की।
प्राथमिक ट्यूमर और ट्यूमर वैक्सीन के बीच पर्याप्त दूरी रखें। यह शारीरिक पृथक्करण दो ट्यूमर प्रत्यारोपण के बीच संभावित संलयन से बचने के लिए महत्वपूर्ण है।
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