Login processing...

JoVE Journal
Cancer Research

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.

JoVE Journal Cancer Research

Experimentell melanomimmunterapimodell med tumörvaccination med ett hematopoetiskt cytokin

Two-dimensional Gel Electrophoresis Coupled with Mass Spectrometry Methods for an Analysis of Human Pituitary Adenoma Tissue Proteome

Journal (Cancer Research)

Two-dimensional Gel Electrophoresis Coupled with Mass Spectrometry Methods for an Analysis of Human Pituitary Adenoma Tissue Proteome

Far-Red Fluorescent Senescence-Associated β-Galactosidase Probe for Identification and Enrichment of Senescent Tumor Cells by Flow Cytometry

Journal (Cancer Research)

Far-Red Fluorescent Senescence-Associated β-Galactosidase Probe for Identification and Enrichment of Senescent Tumor Cells by Flow Cytometry

Click here for the English version

Experimentell melanomimmunterapimodell med tumörvaccination med ett hematopoetiskt cytokin

Article DOI: 10.3791/64082-v

February 24th, 2023 •

Hsin Yu Liu¹, Amnon Altman¹, Ann J. Canonigo-Balancio¹, Michael Croft¹

¹La Jolla Institute for Immunology

Chapters

Summary
Automatic Translation

English (Original)
العربية (Arabic)
中文 (Chinese)
dansk (Danish)
Nederlands (Dutch)
français (French)
Deutsch (German)
עברית (Hebrew)
हिंदी (Hindi)
italiano (Italian)
日本語 (Japanese)
한국어 (Korean)
norsk (Norwegian)
português (Portugese)
русский (Russian)
español (Spanish)
svenska (Swedish)
Türkçe (Turkish)

February 24th, 2023

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Protokollet presenterar en cancerimmunterapimodell med cellbaserad tumörvaccination med Flt3L-uttryckande B16-F10-melanom. Detta protokoll visar procedurerna, inklusive beredning av odlade tumörceller, tumörimplantation, cellbestrålning, mätning av tumörtillväxt, isolering av intratumorala immunceller och flödescytometrianalys.

Transcript

Detta protokoll tillhandahåller klinisk solid tumörimmunterapimodell och en forskningsplattform för att studera förhållandet mellan tumörceller och infiltrerande immunceller. Detta cellbaserade tumörvaccin är bekvämt, enkelt att använda och kan kombineras med andra terapeutiska metoder som checkpointblockad för att uppnå additiv eller synergistisk effekt som kan resultera i mer potent och hög tumörimmunitet. Hjälper till att demonstrera proceduren kommer att vara Ann Balancio, en forskningstekniker från mitt laboratorium.

Till att börja med odla B16-F10 melanomceller i IMDM, innehållande 10% värme inaktiv FBS, 2 millimolär glutamin, 1 millimolar natriumpyruvat, 1 millimolar MEM icke-essentiella aminosyror och 100 enheter per milliliter vardera av penicillin och streptomycin. Håll cellinjen vid 37 grader Celsius med 5% koldioxid. Frö och skörda B16-F10-cellerna enligt beskrivningen i textmanuskriptet.

Ta bort odlingsmediet och tvätta kolvarna en gång med PBS. Aspirera PBS och tillsätt 5 ml 0,25% trypsin-EDTA, följt av att hårt knacka på odlingskolvens kant. Tillsätt 15 ml odlingsmedium för att neutralisera trypsin-EDTA och häll innehållet i kolven i ett 50 ml centrifugrör.

Tvätta diskytan med 10 ml PBS och häll i samma 50 ml centrifugrör. Centrifugera cellerna i 5 minuter vid 200 RCF. Kassera supernatanten och bryt cellpelleten genom att fingra på rörets botten.

Tillsätt kalla 10 ml PBS och pipettera försiktigt cellsuspensionen. Räkna sedan cellerna manuellt med en hemocytometer. Håll cellerna på is före injektion.

Intradermalt implantera 500 000 celler B16-F10 tumörceller i 50 mikroliter kall PBS i vänster flank, med hjälp av en 30 gauge nål. Dosen av implanterade B16-F10-tumörceller kan behöva justeras i ett intervall av 50 000 till 500 000 celler för framgångsrik tumörutveckling. Efter implementering mäter du tumörlängden och bredden tre gånger i veckan med hjälp av en elektronisk digital bromsok.

Beräkna tumörvolymen och behandla mössen med tumörvaccin när tumörerna har nått en storlek på två millimeter som beskrivs i textmanuskriptet. Med hjälp av en röntgenbestrålning inställd på 160 kilovolt och 25 milliampere, bestråla celler vid 150 grå doser gammastrålar. Räkna och kontrollera cellviabiliteten genom trypanblå färgning före injektion.

Injicera mössen intradermalt med 1 miljon bestrålade B16-Flt3L-celler i 50 mikroliter kall PBS på samma flank som den ursprungliga tumörimplantationen. Cirka en centimeter från platsen för den primära tumören på dag 3, 6 och 9 efter den första cellimplantationen. Markera vaccininjektionsställena med en färgad penna för att skilja dem från den primära tumören.

Om 50 000 B16-F10-celler initialt implanterades, rekommenderas att utföra vaccinbehandling på dagarna 8, 11 och 14. Kirurgiskt avlägsnade tumören med huden från varje avlivad mus och lade den i en 24-brunnsplatta med 1 milliliter 10% FBS RPMI 1640-medium. Skär tumörerna i små bitar i två milliliter matsmältningsbuffert och inkubera i 25 minuter vid 37 grader Celsius.

Tillsätt 10 ml 10% FBS RPMI 1640-medium för att stoppa matsmältningen. Överför cellerna till en 40 mikrometer cellsil med en 25 ml serologisk pipett. Använd sedan kolven på en milliliter spruta för att slipa vävnaderna.

Centrifugera cellerna vid 500 RCF i 5 minuter vid 4 grader Celsius. Återsuspendera pelleten i 5 ml 40% densitetsgradientspecifikt medium i PBS utspätt till 1x koncentration. Tillsätt cellsuspensionen långsamt ovanpå 5 ml 80% densitetsgradientspecifikt medium innehållande PBS.

Centrifugera till cellerna vid 325 RCF med låg bromsinställning i 23 minuter vid rumstemperatur. Efter centrifugering, samla försiktigt leukocytskiktet vid gränssnittet mellan 40% och 80% densitetsgradientspecifikt medium och passera det genom en 40 mikrometer cellsil. Centrifugera cellerna vid 500 RCF i 5 minuter vid 4 grader Celsius.

Inkubera pelleten i två milliliter röd blodkroppslysbuffert i fem minuter vid rumstemperatur. Efter inkubation, tillsätt 10 ml 10% FBS RPMI 1640-medium för att släcka RBC-lysbufferten. Centrifugera cellerna vid 400 RCF i 5 minuter vid 4 grader Celsius.

Återsuspendera cellerna i 0,5 ml 10% FBS RPMI 1640-medium och räkna det totala antalet celler före användning för vidare analys. Samla mjälten eller de dränerande lymfkörtlarna som kontroller för grindstrategin för immuncellsdelmängder genom flödescytometrianalys. Följ cellisoleringsmetoden som beskrivs i textmanuskriptet.

En synlig svart prick av de implanterade B16-F10-cellerna observerades vanligtvis på hudytan ungefär tre dagar efter tumörimplantation. Möss behandlades med ett tumörvaccin tre, sex och nio dagar efter att tumörknutan hade nått eller överskridit storleken på två millimeter. En signifikant tumörtillväxtminskning observerades i gruppen vaccinerade möss cirka två veckor efter tumörimplantation.

Celler som samlats in från leukocytskiktet innehöll många tumörceller, vilket gjorde det svårt att enkelt definiera lymfocytpopulationen. Därför användes splenocyt parallellt, för korrekt gating av intratumorala immuncellsdelmängder i flödescytometrianalys. Gatingstrategierna för CD103 positiv, CD11C positiv DC, CD8 positiv, CD4 positiv och Treg plottades tillsammans med kompensationsmatrisen.

Representativa uppgifter om förvärvade konton och frekvens för varje population tillhandahölls också. Intratumoral CD103-positiv, CD11C-positiv DC från vaccinerade möss, visade ett signifikant förhöjt uttryck av den samstimulerande liganden CD86. Vaccinerade möss visade också en ökning av tumörinfiltrerande CD8-positiva och CD4-positiva, Foxp3-negativa celler, liksom i CD8-positiva granzym B-positiva och interferon gammapositiva CTL.

Håll ett tillräckligt avstånd mellan den primära tumören och tumörvaccinet. Denna fysiska separation är avgörande för att undvika potentiell fusion mellan de två tumörimplantaten.

X

Simple Hit Counter