Biochemistry
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पील-ब्लोट तकनीक: बहु-स्तरित या केंद्रित जैविक नमूनों से एकल परतों को अलग करने के लिए एक क्रायो-ईएम नमूना तैयारी विधि
Chapters
Summary June 29th, 2022
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पील-ब्लॉट तकनीक एक क्रायो-ईएम ग्रिड तैयारी विधि है जो मोटाई को कम करने, नमूना एकाग्रता बढ़ाने और छवि प्रसंस्करण की सुविधा के लिए एकल परतों में बहुस्तरीय और केंद्रित जैविक नमूनों को अलग करने की अनुमति देती है।
Transcript
पील-ब्लॉट तकनीक मोटाई को कम करने, एकाग्रता बढ़ाने और छवि प्रसंस्करण की सुविधा के लिए एकल परतों में बहु-स्तरित और केंद्रित जैविक क्रायो-ईएम नमूनों को अलग करने की अनुमति देती है। ग्रिड तैयारी से पहले नमूना सांद्रता बढ़ाई जा सकती है, और पील-ब्लॉट को अत्यधिक कुशल डेटा संग्रह के लिए एकल-स्तरित नमूनों के घने वितरण के परिणामस्वरूप समायोजित किया जा सकता है। शुरू करने के लिए, 20-25 माइक्रोमीटर छिद्र आकार के फिल्टर पेपर के दो टुकड़ों को ढेर करें और कागज के सामने एक लंबी पैराफिन फिल्म रखें।
फिल्टर पेपर के दो अतिरिक्त टुकड़ों के शीर्ष पर सबमाइक्रोन फिल्टर पेपर का एक टुकड़ा रखें। एंटी-केशिका बल को मुड़े हुए पैर के साथ रखें और सीधे पैर को नीचे की ओर रखें और चिकनी या चमकदार साइड के साथ 600 जाल ग्रिड का चयन करें। अन्य वस्तुओं के साथ स्वच्छ ग्रिड के संपर्क से बचने के लिए पेट्री डिश या अन्य उभरी हुई सतह पर फोर्सप्स रखें।
पैराफिन फिल्म से पेपर निकालें और एक छोटा रिम बनाने के लिए पक्षों को खींचें। पिपेट दो 150 माइक्रोलीटर गिराते हैं जो पैराफिन फिल्म के एक छोटे से हिस्से से लगभग एक से दो सेंटीमीटर पर 4% ट्रेहलोस समाधान है। दो बूंदें लगभग एक सेंटीमीटर अलग होनी चाहिए।
इसके बाद, एक अलग बेंच पर या फर्श पर, एक छोटे पॉलीस्टाइनिन फोम कंटेनर में तरल नाइट्रोजन डालें और तरल नाइट्रोजन में एक छोटा क्रायो-ईएम ग्रिड कंटेनर रखें। लिंट-फ्री वाइप्स के साथ पॉलीस्टाइनिन फोम कंटेनर को कवर करें। अभ्रक से कार्बन फिल्म को तैरने के लिए, ड्यूमोंट 5 फोर्सप्स का उपयोग करें और ट्रेहलोस घोल की बूंदों में से एक पर नीचे की ओर मामूली कोण पर अभ्रक के एक तरफ स्पर्श करें।
अभ्रक को नीचे की ओर ले जाएं ताकि पानी का तनाव धीरे-धीरे कार्बन फिल्म से ऊपर उठ सके। बूंद की सतह पर कार्बन फिल्म तैरने के बाद अभ्रक जारी करें। फ्रैक्चर के रूप में क्षति के साथ कार्बन का उपयोग करने से बचने के लिए कार्बन फिल्म का नेत्रहीन निरीक्षण करें।
एंटी-केशिका बल द्वारा पकड़े गए ग्रिड को 20-30 डिग्री कोण पर ट्रेहलोस ड्रॉप में बगल की स्थिति में डालें, और फिर कार्बन फिल्म के नीचे ग्रिड को केंद्रित करें। कार्बन फिल्म उठाएं, ग्रिड को उसी अभिविन्यास में रखें और धीरे-धीरे बूंद की सतह के तनाव को तोड़ने के बिना ट्रेहलोस की दूसरी बूंद की सतह पर ग्रिड को कम करें। यह अनावश्यक कार्बन फिल्म को हटा देगा जो ग्रिड के रिम के चारों ओर खुरदरी तरफ लपेटा जा सकता है।
एंटी-केशिका बलों को घुमाएं और उन्हें ग्रिड के कार्बन पक्ष के साथ पेट्री डिश पर रखें। ग्रिड के शीर्ष पर मामूली ट्रेहलोस मेनिस्कस में नमूने के 1.3 माइक्रोलीटर पिपेट। फिर, ट्रेहलोस और नमूने को ग्रिड के दोनों किनारों पर मिलाने और वितरित करने के लिए समाधान को लगभग 8-10 बार पिपेट करें।
एक मिनट के लिए ग्रिड पर नमूना ट्रेहलोस समाधान को इनक्यूबेट करते समय पैराफिन फिल्म पर ट्रेहलोस समाधान की एक या अधिक 1.7 माइक्रोलीटर बूंदें डालें। ग्रिड को कार्बन फिल्म के सामने अपनी मूल स्थिति में वापस घुमाएं और एंटी-केशिका बल का उपयोग करके ग्रिड को सबमाइक्रोन फिल्टर पेपर पर दबाएं। एक बार जब समाधान फिल्टर पेपर द्वारा अवशोषित हो जाता है और कार्बन फिल्म सपाट पड़ी होती है, तो ग्रिड को उठाने से पहले तीन सेकंड तक प्रतीक्षा करें और इसे ट्रेहलोस समाधान की 1.7 माइक्रोलीटर बूंद पर लंबवत रूप से ले जाएं।
नमूने के आधार पर इन चरणों को एक से तीन पुनरावृत्ति या अधिक के बीच दोहराया जा सकता है। फिल्टर पेपर के दो टुकड़ों पर ग्रिड को ब्लोट करें और फिर फिल्टर पेपर से ग्रिड उठाएं। लगभग 13 सेकंड के बाद, आर्द्रता और नमूना बफर के आधार पर, ग्रिड को छोटे स्टायरोफोम कंटेनर में तरल नाइट्रोजन में डुबोएं और इसे क्रायो-ईएम ग्रिड कंटेनर में रखें या इसे सीधे क्रायो-ईएम स्क्रीनिंग या डेटा संग्रह के लिए स्थानांतरित करें।
पील-ब्लॉट विधि के अधीन मानव ल्यूकोट्रिएन सी 4 सिंथेज़ का एक 2 डी क्रिस्टल नमूना यहां दिखाया गया है। तीर के बाईं ओर का क्षेत्र काफी हद तक कार्बन फिल्म और ग्रिड बार के बीच एक संपर्क क्षेत्र में एकल-स्तरित 2 डी क्रिस्टल तक कम हो गया था जिसे छील-धब्बा किया गया था और फिर स्थानांतरित कर दिया गया था। तीर के दाईं ओर का क्षेत्र छिलके-धब्बा से प्रभावित नहीं था।
छवि का निचला आधा हिस्सा पील-ब्लोट के आवेदन के परिणामस्वरूप बड़े, ज्यादातर एकल-स्तरित फॉस्फो लिपिड बाइलेयर वाले क्षेत्रों का प्रतिनिधित्व करता है। ऊपरी आधा हिस्सा ग्रिड बार और कार्बन फिल्म के बीच संपर्क क्षेत्र में नहीं था, और इस प्रकार इसमें दो फॉस्फोलिपिड बाइलेयर के साथ पूर्ण लिपोसोम शामिल थे। 400 जाल ग्रिड का ग्रिड वर्ग ग्रिड बार के पदचिह्न और परिणामस्वरूप छिलके-धब्बा वाले क्षेत्रों के साथ-साथ उन क्षेत्रों को दर्शाता है जो ग्रिड बार के संपर्क में नहीं थे या कम पील-ब्लॉट पुनरावृत्तियों के अधीन थे।
इन छवियों में बहुत पतली कार्बन फिल्म का उपयोग करके एक सबमाइक्रोन फिल्टर पेपर पर बैक इंजेक्शन द्वारा तैयार ईएम ग्रिड के सोख्ता को दिखाया गया था। छवियां झिल्ली के साथ प्रारंभिक संपर्क में एकल फ्रेम हैं, संपर्क के 1,000 मिलीसेकंड बाद, और संपर्क के बाद 2,000 मिलीसेकंड। तीर ग्रिड वर्गों को इंगित करता है जहां केशिका दबाव ने कार्बन फिल्म को तोड़ दिया।
कार्बन फिल्म में फ्रैक्चर से बचना और सबमाइक्रोन फिल्टर पेपर को 1.7 माइक्रोलीटर ट्रेहलोस ड्रॉप के साथ मिलाकर सक्शन करना और फिर परतों को अलग करना महत्वपूर्ण कदम हैं। छिलके-धब्बेदार नमूनों का उपयोग उच्च रिज़ॉल्यूशन क्रायो-ईएम डेटा संग्रह के लिए किया जाता है, इसके बाद संरचना निर्धारण के लिए छवि प्रसंस्करण होता है। पील-ब्लॉट एकल-स्तरित प्रोटीन 2 डी क्रिस्टल के संरचित निर्धारण की अनुमति देता है जो पहले क्रायो-ईएम के लिए बहुत मोटे थे।
इसके अलावा, यह कार्बन फिल्म पर एकल परतों में विभिन्न नमूनों को केंद्रित कर सकता है।
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