Mild isolering av kärnor från hjärnvävnaden hos vuxna afrikanska turkosa killifiskar, en naturligt kortlivad modell för åldrandeforskning

Detta är det första optimerade protokollet för att isolera högkvalitativa kärnor för sekvenseringsexperiment med en kärna med frysta hjärnor av afrikansk turkos killifish, en framväxande ryggradsdjursmodell för åldrandeforskning. Detta protokoll isolerar kärnor mycket försiktigt vilket skiljer det från hårdare protokoll optimerade för andra organismer med mer myeliniserade hjärnor, vilket resulterar i nedbrutna kärnor när de används i killifish. Denna metod kommer att vara avgörande för att hjälpa oss att förstå hjärnans åldrande på encellsnivå.

Det bör översättas väl till andra vävnader som kräver mer mild kärnisolering. Detta protokoll är användarvänligt. Den mest krävande uppgiften är gradientcentrifugeringen för borttagning av skräp, där det är bättre att vara långsam och exakt än snabb och rörig.

Demonstrerar proceduren kommer att vara Ari Adler och Brian Teefy, en forskningslabbtekniker och en postdoktor från Benayoun-laboratoriet. Efter dissekering av killifisken, tina den frusna hjärnvävnaden på is i 10 minuter och slå hjärnan i en milliliter iskall kärnlysbuffert i en två-milliliter dounce homogenisator. Håll homogenisatorn på is medan du lyserar provet och undvik att generera bubblor.

Kasta vävnaden enligt beskrivningen i manuskriptet och låt provet vila på is i dounce-homogenisatorn i två minuter. Sila sedan provet genom ett 70-mikrometer cellfilter i ett 15-milliliter koniskt rör förbelagt med 5% BSA. Tillsätt fyra milliliter kärntvättbuffert till provet genom att pipettera tvättbufferten över 70-mikrometercellfiltret och blanda genom att försiktigt invertera röret fem gånger.

Använd en svängande skoprotor och centrifugera provet vid 500 G i 10 minuter vid fyra grader Celsius. Kassera supernatanten genom att försiktigt hälla den i en behållare för flytande avfall. Håll provet upprätt och ta bort den återstående tvättbufferten med en P1000-pipett.

Återsuspendera omedelbart kärnorna i en milliliter kärntvättbuffert med en bred P1000-pipettspets. Ta sedan provet till fem milliliter genom att tillsätta fyra milliliter kärntvättbuffert och blanda som visats tidigare. Pellet cellen genom centrifugering.

Kassera supernatanten och återsuspendera kärnorna i en milliliter kärntvättbuffert med en bred borrpipettspets. Överför nu kärnorna till ett flödescytometrirör. Tillsätt 300 mikroliter skräpborttagningslösning till cellsuspensionen och blanda den noggrant genom pipettering med en bred borrspets tills blandningen är homogen.

Håll röret i en liten vinkel och lägg försiktigt över en milliliter kärntvättbuffert ovanpå kärnlösningen med en P1000-pipett. Centrifugera provet i en svängande skoprotor vid 3000 G i 10 minuter vid fyra grader Celsius. Kassera helt de två översta faserna med en P1000-pipett.

Överför bottenskiktet till ett 15-milliliter koniskt rör förbelagt med 5% BSA. Ta sedan volymen till 15 ml med kärntvättbuffert och blanda genom att invertera röret tre gånger. Centrifugera röret vid 1000G i 10 minuter vid fyra grader Celsius i en svängande skoprotor.

Ta bort supernatanten försiktigt och återsuspendera omedelbart pelleten i 150 mikroliter kärntvättbuffert med en bred borrpipettspets. Byt till en standardborrningspipettspets inställd på 300 mikroliter. Pipettera hela provet och fäst sedan ett 40-mikrometer on-tip-filter i slutet av pipettspetsen.

Filtrera provet genom att kraftigt driva ut provet genom filtret i ett lågt DNA-bindande, 1,5 ml mikrocentrifugrör. I ett FACS-rör, återsuspendera 10 mikroliter av det filtrerade kärnprovet i 90 mikroliter av den rekommenderade flödescytometribufferten. Färga proverna med propidiumjodid i en slutlig koncentration av ett mikrogram per ml.

När du har ställt in arbetsytan enligt beskrivningen i manuskriptet startar du flödet genom att trycka på uppspelningsikonen längst ned till höger. Kontrollera om det finns luftbubblor eller klumpar i provet med hjälp av sidospridningsområdet kontra HDRT. Kontrollera också sidopunktsdiagrammet kontra framåtspridningsdiagrammet för att verifiera att händelserna ackumuleras inom fönstrets gränser.

Om du vill ha en förstorad vy dubbelklickar du på sidospridningsområdet jämfört med diagrammet PerCP-Vio700-A. Klicka på knappen i det övre vänstra verktygsfältet med en vinkelrät linje för att välja en kvadrantgrind. Klicka sedan var som helst i sidospridningsområdet jämfört med PerCP-Vio700-A-diagrammet så visas kvadranter inuti diagrammet.

Klicka var som helst på kvadrantens skiljelinjer och skjut markören för att ändra kvadrantplaceringen. Placera kvadranterna så att den övre vänstra kvadranten innehåller skräp och den övre högra kvadranten innehåller kärnor. Klicka på kvadraten, grå, I-ikonen för att öppna egenskapsfönstret.

Gå till fliken regionfunktioner och se till att det finns en grön bock bredvid det översta objektet, vilket indikerar att hela diagrammet är valt. Under funktionslistan klickar du på räkna per mikroliter för att skapa en grön bock. Klicka på OK så visas ett antal per mikroliter för varje kvadrant.

Välj antal och procent totalt på fliken regionfunktioner för att visa råantal och procentsatser om du vill. Rita en polygonal grind runt denna population genom att klicka på polygonknappen i det övre vänstra verktygsfältet. Klicka sedan en enda gång och skjut musen för att rita ett linjärt segment av porten.

Klicka igen för att avsluta och börja nästa, följt av ett dubbelklick för att avsluta porten. Klicka på grindens kant och skjut musen för att flytta grinden. Klicka på portens hörn för att ändra formen, och antalet per mikroliter av den gated populationen visas.

Friska kärnor som uppträdde som singletkärnor med intakta membran är lämpliga för nedströmsanalys. Ohälsosamma kärnor kännetecknas emellertid av skadade kärnmembran, vilket leder till att kärnor klumpar sig och kan bidra till bakgrundssignaler i nedströmsapplikationer. Kärnor är i singlet- och multipletformer i den övre högra kvadranten, med singlets som det lägsta molnet av händelser följt av dubletter och trillingar i stigande ordning.

Skräp präglas av händelser i de två vänstra kvadranterna i ett kärnpreparat av låg kvalitet där skräpborttagningssteget utelämnades. Skräp utgör mer än 40% av händelserna. Men i ett högkvalitativt experiment utgör skräp mindre än 15% av alla händelser.

Det är absolut nödvändigt att helt avlägsna mellanskiktet efter centrifugeringssteget för skräpavlägsnande för att minska förorenande bakgrunds-RNA-kärnor isolerade med hjälp av detta protokoll kan användas för enkärnig RNA-sekvensering eller ATAC-sekvensering för att erhålla transkriptomisk och epigenetisk information på encellsnivå. Denna teknik kommer att göra det möjligt för forskare att utforska hjärnans genreglering på encellsnivå i den afrikanska turkosa killifishen, en naturligt kortlivad ryggradsdjurmodellorganism för åldrandeforskning.