Cancer Research
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Измерение сжимаемости клеток и ядер на основе акустофлюидного микроустройства
Chapters
Summary July 14th, 2022
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Здесь представлен протокол построения быстрой и неразрушающей системы измерения сжимаемости клеток или ядер на основе акустофлюидного микроустройства. Исследованы изменения механических свойств опухолевых клеток после эпителиально-мезенхимального перехода или ионизирующего излучения, демонстрирующие перспективу применения данного метода в научных исследованиях и клинической практике.
Transcript
Клеточная механика играет важную роль в метастазировании опухоли, злокачественной трансформации клеток и радиочувствительности. Акустофлюидный метод позволяет осуществлять быстрое и неразрушающее измерение в взвешенных состояниях. Данная методика может быть использована для зеркального отражения изменения самосжима при эпителиальном переходе в мезенхимальное и разделения циркулирующих опухолевых клеток, показывая перспективы его применения в диагностике рака.
Для начала свяжите блок PDMS с чипом, пробивая отверстия в блоке PDMS для входных и выходных портов полой иглой диаметром один миллиметр. Затем поместите блоки PDMS и чип с задней стороной вверх в плазменный очиститель на одну минуту. После выравнивания отверстий на блоках PDMS с входным и выходным отверстием чипа осторожно прижмите блоки PDMS к чипу в течение 15 секунд, в результате чего между блоками PDMS и поверхностью чипа произойдет склеивание.
Чтобы подключить катетер из PTFE к чипу, отрежьте два куска катетера с внутренним диаметром 0,8 миллиметра и длиной 10 сантиметров. Согните иглу из нержавеющей стали с внутренним диаметром 0,7 миллиметра и длиной 1,5 сантиметра на 90 градусов в L-образную форму и соедините ее с одним концом катетера. Вставьте иглы из нержавеющей стали в отверстия блоков PDMS.
Для входного отверстия подключите дозирующую иглу 19 калибра к другому концу катетера в качестве разъема для шприца. После этого введите деионизированную воду, чтобы проверить герметичность общего канала. Для пьезоэлектрической керамической сборки выбирайте предварительно нарезанные пьезоэлектрические керамические листы шириной пять миллиметров.
Затем свариваем проволоку с обеих сторон пьезоэлектрической керамики на одном конце. Приклейте пьезоэлектрическую керамику к середине задней части чипа, поместив каплю цианоакрилатного клея на пьезоэлектрическую керамику. Разгладьте клей зубочисткой и удалите лишний клей.
Затем быстро нажмите его на чип и продолжайте нажимать около одной минуты. Чтобы смонтировать микроустройство, вырежьте кусок PDMS в качестве основания микроустройства и приклейте одну сторону основания к блокам PDMS, а другую сторону к прозрачному стеклянному слайду с помощью двусторонней ленты. Закрепите все микроустройство на ступени микроскопа, чтобы сохранить чип в одной фокальной плоскости.
Для приготовления растворов стандартных частиц полистирола добавляют 0,05 миллилитра раствора частиц полистирола на 10 миллилитр ПБС и хорошо перемешивают. Затем готовят клеточные суспензии, промывая адгезивные клетки при 90% слиянии с PBS. Добавьте 500 микролитров 0,25 трипсина в течение одной-двух минут при комнатной температуре.
После удаления трипсина добавляют один миллилитр полной среды и образуют клеточную суспензию путем пипетирования. Далее центрифугируют клеточную суспензию при 100 Г в течение пяти минут. Удаляют супернатант и повторно суспендируют в 0,5-одном миллилитре PBS с целью получения клеточной суспензии.
Затем клетки подсчитывали гемоцитометром и концентрация составляла от 300 до 500 000 клеток на миллилитр. После приготовления суспензии клеточного ядра, как показано ранее, удаляют надосадочный агент и добавляют 200 микролитров реагента для экстракции цитоплазматического белка А на 20 микролитр клеточной палитры и хорошо перемешивают. Затем вихрьте вышеуказанную смесь при 220 г в течение пяти секунд и поместите на ледяную ванну на 10 минут.
Далее добавляют 10 микролитров реагента для экстракции цитоплазматического белка В в раствор после инкубации. После вихря поместите на ледяную ванну на одну минуту и снова вихрь при 220 G в течение пяти секунд. Затем, наконец, центрифуга при 1000 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия.
Удалите супернатант и повторно суспендируйте палитру в одном миллилитре PBS. Затем центрифуга при 1000 G при четырех градусах Цельсия в течение четырех минут. После удаления супернатанта повторно суспендируют в 100 микролитрах PBS в виде суспензии клеточного ядра.
Добавьте трипан синего цвета в суспензию ядра вышеуказанной клетки и окрашивайте при комнатной температуре в течение четырех минут. Далее подсчитайте количество ядер под инвертированным микроскопом с 10-кратным объективом. Разбавляют суспензию ядра вышеуказанной клетки буфером PBS до концентрации от 200 до 300 000 ядер на миллилитр.
Затем отфильтруйте суспензию клеточного ядра через 70-микрометровое сито. Чтобы настроить измерительную систему, включите источник света микроскопа и откройте программное обеспечение камеры. Используйте объектив 4x, чтобы найти среднее положение микроканала, то есть положение пьезоэлектрической керамики.
После соединения проводов приваривайте их к положительным и отрицательным клеммам выходного сигнального генератора из пьезоэлектрической керамики соответственно. Затем поместите шприц на микроинъекционный насос и подключите его к входному катетеру. Чтобы собрать жидкость из микроканала, поместите небольшой контейнер в конце выходного катетера.
Для определения параметров измерения аспирируйте раствор частиц полистирола шприцем. Затем впрыскивайте раствор в микроканал чипа, избегая пузырьков воздуха, и в микроканал чипа для обеспечения точного измерения. Установите выход генератора сигналов на знаковый сигнал с частотой один мегагерц и пиковым напряжением 10 вольт до тех пор, пока не будет замечено, что частицы движутся к средней линии микроканала и остаются в прямом движении вдоль средней линии после достижения средней линии.
После смешивания одной миллилитровой клетки или суспензии ядра со стандартным раствором частиц в соотношении один к одному вводят его в микроканал шприцем для измерения клеток и ядер. Начните запись с помощью ПЗС-камеры, когда клетки или ядра войдут в поле зрения и включите генератор сигналов. Затем промыть микроканал деионизированной водой, 75% спиртом и деионизированной водой последовательно для последующего использования.
Движение клеток и частиц наблюдалось под действием силы акустического поля в сторону средней линии микроканала на разных временных интервалах. Был выполнен расчет энергии, плотности и сжимаемости ячейки, получена плотность акустической энергии и измеренная траектория движения частицы из наилучшего результата подгонки. Высокая чистота и интактные ядра были выделены из клеток, а измерение сжимаемости ядра было достигнуто путем получения траектории движения ядра.
Измеряли и сравнивали сжимаемость различных типов раковых клеток и клеток после медикаментозного ЭМТ или рентгеновского облучения различными дозами. Измеренные клетки были собраны, и было обнаружено, что не было существенной разницы в пролиферации и жизнеспособности клеток по сравнению с необработанной группой после 48 часов культивирования. Указание на то, что измерение сжимаемости не влияет на пролиферацию и выживание клеток.
Самое главное — точно настроить частоту сигнала до тех пор, пока не будет замечено, что частицы движутся к средней линии микроканала.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
