Cancer Research
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Akustoakışkan Mikrocihaz Temelinde Hücre ve Çekirdeğin Sıkıştırılabilirliğinin Ölçülmesi
Chapters
Summary July 14th, 2022
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Burada, akustoakışkan mikrocihaza dayalı hücre veya çekirdek sıkıştırılabilirliğini ölçmek için hızlı ve tahribatsız bir sistem oluşturmak için bir protokol sunulmaktadır. Epitelyal-mezenkimal geçiş veya iyonlaştırıcı radyasyon sonrası tümör hücrelerinin mekanik özelliklerinde meydana gelen değişiklikler araştırılarak bu yöntemin bilimsel araştırma ve klinik pratikte uygulama olasılığı ortaya konmuştur.
Transcript
Hücre mekaniği tümör metastazında, hücrelerin malign transformasyonunda ve radyosensitivitede önemli rol oynamaktadır. Akustoakışkan yöntem, askıya alınmış durumlarda hızlı ve tahribatsız ölçüm gerçekleştirebilir. Bu teknik, epitelyalden mezenkimal geçişe geçişte kendi kendine sıkıştırılabilirliğin değişimini yansıtmak ve dolaşımdaki tümör hücrelerini ayırmak, kanser teşhisinde uygulama umutlarını göstermek için kullanılabilir.
Başlamak için, bir milimetre çapında içi boş bir iğne ile giriş ve çıkış portları için PDMS bloğunda delikler açarak PDMS bloğunu çipe bağlayın. Ardından PDMS bloklarını yerleştirin ve arka tarafı yukarı bakacak şekilde bir dakika boyunca plazma temizleyiciye yerleştirin. PDMS bloklarındaki delikleri çip giriş ve çıkışı ile hizaladıktan sonra, PDMS bloklarını çipe 15 saniye boyunca hafifçe bastırın, böylece PDMS blokları ile çipin yüzeyi arasında yapışma meydana gelir.
PTFE kateterini çipe bağlamak için, iç çapı 0,8 milimetre ve uzunluğu 10 santimetre olan iki parça kateter kesin. İç çapı 0,7 milimetre ve uzunluğu 1,5 santimetre olan paslanmaz çelik iğneyi 90 derece L şeklinde bükün ve kateterin bir ucuna bağlayın. Paslanmaz çelik iğneleri PDMS bloklarının deliklerine yerleştirin.
Giriş için, bir şırınga için bir konektör olarak kateterin diğer ucuna 19 gauge dağıtım iğnesi bağlayın. Daha sonra, genel kanalın sıkılığını test etmek için deiyonize su enjekte edin. Piezoelektrik seramik tertibatı için, beş milimetre genişliğinde önceden kesilmiş piezoelektrik seramik levhaları seçin.
Daha sonra piezoelektrik seramiğin her iki tarafındaki telleri bir ucunda kaynaklayın. Piezoelektrik seramiğin üzerine bir damla siyanoakrilat yapıştırıcı yerleştirerek piezoelektrik seramiği çipin arkasının ortasına yapıştırın. Tutkalı kürdan ile pürüzsüzleştirin ve fazla yapıştırıcıyı çıkarın.
Ardından çipin üzerine hızlıca bastırın ve yaklaşık bir dakika boyunca basmaya devam edin. Mikro cihazı monte etmek için, mikro cihazın tabanı olarak bir parça PDMS kesin ve tabanın bir tarafını giriş ve çıkış PDMS bloklarına, diğer tarafını ise çift taraflı bant kullanarak şeffaf bir cam slayda yapıştırın. Çipi tek bir odak düzleminde tutmak için tüm mikro cihazı mikroskop aşamasına sabitleyin.
Polistiren standart partikül çözeltilerini hazırlamak için 10 mililitre PBS'ye 0.05 mililitre polistiren partikül çözeltisi ekleyin ve iyice karıştırın. Daha sonra yapışkan hücreleri PBS ile% 90 oranında yıkayarak hücre süspansiyonlarını hazırlayın. Oda sıcaklığında bir ila iki dakika boyunca 500 mikrolitre 0.25 Tripsin ekleyin.
Tripsini çıkardıktan sonra, bir mililitre tam ortam ekleyin ve pipetleme ile bir hücre süspansiyonu oluşturun. Daha sonra hücre süspansiyonunu beş dakika boyunca 100 G'de santrifüj edin. Süpernatantı çıkarın ve bir hücre süspansiyonu elde etmek için 0,5 ila bir mililitre PBS'de yeniden askıya alın.
Daha sonra hücreler bir hemositometre ile sayıldı ve konsantrasyon mililitre başına yaklaşık 300 ila 500.000 hücre idi. Daha önce gösterildiği gibi hücre çekirdeği süspansiyonunu hazırladıktan sonra, süpernatantı çıkarın ve 20 mikrolitre hücre paleti başına 200 mikrolitre sitoplazmik protein ekstraksiyon reaktifi A ekleyin ve iyice karıştırın. Daha sonra yukarıdaki karışımı beş saniye boyunca 220 G'de vorteks yapın ve 10 dakika boyunca buz banyosuna koyun.
Daha sonra, inkübasyondan sonra çözeltiye 10 mikrolitre sitoplazmik protein ekstraksiyon reaktifi B ekleyin. Girdaptan sonra, bir dakika boyunca buz banyosuna yerleştirin ve beş saniye boyunca 220 G'de tekrar vorteks yapın. Ardından, son olarak, dört santigrat derecede beş dakika boyunca 1000 G'de santrifüj yapın.
Süpernatantı çıkarın ve paleti bir mililitre PBS içinde yeniden askıya alın. Daha sonra dört dakika boyunca dört santigrat derecede 1000 G'de santrifüj yapın. Süpernatan çıkarıldıktan sonra, hücre çekirdeği süspansiyonu olarak 100 mikrolitre PBS'de yeniden askıya alın.
Yukarıdaki hücre çekirdeği süspansiyonuna tripan mavisi ekleyin ve oda sıcaklığında dört dakika boyunca lekeleyin. Ardından, ters çevrilmiş mikroskop altındaki çekirdek sayısını 10x hedefle sayın. Yukarıdaki hücre çekirdeği süspansiyonunu PBS tamponu ile mililitre başına 200 ila 300.000 çekirdek konsantrasyonuna kadar seyreltin.
Daha sonra hücre çekirdeği süspansiyonunu 70 mikrometrelik bir elek ile filtreleyin. Ölçüm sistemini kurmak için mikroskobun ışık kaynağını açın ve kamera yazılımını açın. Mikrokanalın orta konumunu, yani piezoelektrik seramiğin konumunu bulmak için 4x hedefini kullanın.
Telleri bağladıktan sonra, sırasıyla piezoelektrik seramiğin sinyal üreteci çıkışının pozitif ve negatif terminallerine kaynak yapın. Daha sonra şırıngayı mikroenjeksiyon pompasına yerleştirin ve giriş kateterine bağlayın. Sıvıyı mikrokanaldan toplamak için, çıkış kateterinin sonuna küçük bir kap yerleştirin.
Ölçüm parametrelerini belirlemek için, polistiren partikül çözeltisini şırınga ile aspire edin. Ardından, doğru ölçümü sağlamak için hava kabarcıklarından kaçınırken ve çip mikrokanalında çözeltiyi çip mikrokanalına enjekte edin. Sinyal üretecinin çıkışını, parçacıkların mikrokanalın orta hattına doğru hareket ettiği ve orta hatta ulaştıktan sonra orta hat boyunca ileri yönde hareket ettiği gözlemlenene kadar bir megahertz frekanslı ve 10 voltluk tepeden tepeye voltajlı bir işaret sinyaline ayarlayın.
Bir mililitrelik hücre veya çekirdek süspansiyonunu standart parçacık çözeltisi ile bire bir oranında karıştırdıktan sonra, hücreleri ve çekirdekleri ölçmek için bir şırınga ile mikrokanala enjekte edin. Hücreler veya çekirdekler görüş alanına girdiğinde CCD kamera ile kayda başlayın ve sinyal üretecini açın. Daha sonra mikrokanalı daha sonra kullanmak üzere sırayla deiyonize su,% 75 alkol ve deiyonize su ile durulayın.
Hücrelerin ve parçacıkların hareketi, akustik alan kuvvetinin etkisi altında farklı zaman aralıklarında mikrokanalın orta hattına doğru gözlendi. Enerji, yoğunluk ve hücre sıkıştırılabilirliğinin hesaplanması yapıldı ve akustik enerji yoğunluğu ve parçacık için ölçülen hareket yörüngesi en uygun sonuçtan elde edildi. Yüksek saflıkta ve bozulmamış çekirdekler hücrelerden izole edildi ve çekirdeğin hareket yörüngesi elde edilerek çekirdek sıkıştırılabilirlik ölçümü yapıldı.
İlaca bağlı EMT veya röntgen ışınlamasından sonra farklı tipte kanser hücrelerinin ve hücrelerinin farklı dozlarla sıkıştırılabilirliği ölçüldü ve karşılaştırıldı. Ölçülen hücreler toplandı ve 48 saatlik kültürden sonra tedavi edilmeyen gruba kıyasla hücre proliferasyonu ve canlılığında anlamlı bir fark olmadığı bulundu. Sıkıştırılabilirlik ölçümünün hücre çoğalması ve sağkalımı üzerinde hiçbir etkisi olmadığını gösterir.
En önemli şey, parçacıkların mikrokanalın orta hattına doğru hareket ettiği gözlemlenene kadar sinyalin frekansına ince ayar yapmaktır.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
